唉 又是被工程化外泌体水凝胶硬控的一天

         以组织收缩力减弱及高糖缺氧环境下伤口细胞存活受抑为特征的慢性难愈性皮肤创面，是糖尿病治疗面临的重大挑战。本研究开发了一种具有强组织粘附性的自收缩生物活性核壳微凝胶组装体（SMART-EXO），可加速糖尿病伤口愈合。该敷料凭借丰富的氢键和动态配位键实现与损伤组织的强可逆粘附。核壳微凝胶组分与动态配位键共同赋予材料适中刚度、可调控自收缩性能及互联多孔结构。SMART-EXO敷料触发的原位自收缩能主动可调地促进创面收缩，通过激活皮肤机械信号转导，优化成纤维细胞-肌成纤维细胞转化、胶原合成及血管新生。同步收缩作用还实现了生物活性外泌体的高效负载与按需释放，促进糖尿病小鼠创面再上皮化和微环境调控。RNA测序结果显示其同时激活了机械传感与外泌体调控的关键信号通路，揭示了力学-生化协同作用机制。这些发现表明SMART-EXO为糖尿病创面治疗这一复杂难题提供了多功能适应性解决方案。本文于2024年9月发表在《Advanced Materials》IF：27.4期刊上。

图像摘要

主要实验结果如下：

1、具有强组织粘附性的自收缩微凝胶组装体（SMART）的制备与表征

         首先采用N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）和丙烯酸（AAC）单体，通过改进的沉淀聚合法制备了NIPAM-co-AAC微凝胶（图1A,B）。透射电子显微镜（TEM）图像显示微凝胶具有明显的核壳结构（图1C），动态光散射（DLS）检测表明其流体力学直径为1.83 µm（图1D）。随着温度升高，微凝胶尺寸逐渐减小，当环境温度达到约37°C的低临界溶解温度（LCST）时，可观察到明显的尺寸骤降现象（图1E；支持信息图S1）。这一现象归因于微凝胶聚合物链段中同时存在亲水性酰胺基团和疏水性异丙基基团：温度升高时，酰胺基与异丙基之间的链内氢键增强，破坏了酰胺基与水分子间的氢键作用，导致疏水相互作用占据主导，引发链段收缩和水分排出，从而使微凝胶尺寸减小。

         加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）后，这些微凝胶进一步自组装形成自收缩微凝胶组装体（SMA）。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像显示，单分散微凝胶逐渐聚集形成数十微米尺度的结构，最终形成大型微凝胶组装体（图1F）。48小时后获得具有多孔结构的圆盘状组装体（图1G），其三维结构由紧密堆积的微凝胶构成（图1H；支持信息图S2）。该微凝胶还可组装成心形、三角形等不同形状（支持信息图S3），以适应不同应用场景。

         为构建具有强组织粘附性的SMART组装体，在SMA中引入了聚丙烯酸（PAA）-Ca²⁺次级网络（图1I）。与SMA表面光滑的微凝胶相比，SMART截面呈现相互连通的孔状结构（图1J）。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）显示，SMA在1731、1779和1810 cm⁻¹处出现特征峰，分别对应NHS-酰亚胺的νs（C=O）、NHS-酰亚胺的νs（C=O）和NHS-酯的νs（C=O）（图1K）。引入PAA网络后，SMART在1712 cm⁻¹处的C=O特征吸收峰显著增强。

         通过频率扫描流变分析发现，储能模量（G'）始终大于损耗模量（G''），符合本体凝胶特性（图1L）。SMA和SMART均表现出显著的频率依赖性，表明体系中存在超分子相互作用。由于PAA-Ca²⁺网络的引入，SMART的G'值明显高于SMA，且在应变扫描测试中屈服点右移（图1M）。两种微凝胶组装体均呈现剪切稀化行为，表现为粘度随剪切速率增加而线性下降（支持信息图S4）。交替高低应变的时间扫描实验证实，SMART具有优异的剪切稀化和自修复性能，这与切割-愈合实验现象一致（图1N,O）。

         传统均相水凝胶（如PNIPAM温敏水凝胶）通常响应迟缓，需较长时间达到溶胀/收缩平衡（支持信息图S5）[29,30]。相比之下，核壳结构微凝胶具有致密核层与疏松壳层，赋予材料适中力学性能。微小的尺寸和更大的比表面积使其对环境变化更敏感，能快速达到溶胀/收缩平衡。因此，SMART具有快速温度响应特性，更有利于调控创面机械收缩。此外，SMART优异的自修复性能源于羧基间氢键及羧基-Ca²⁺动态配位作用，通过简单调节交联点密度即可实现力学性能的可控调节。

图1 组装的水凝胶导致形成的SMART表现出优质的机械性能

2、SMART敷料通过程序化自收缩实现外泌体的自发装载与持续释放

         基于微凝胶固有的触发自收缩特性，SMART敷料在接近正常体温条件下可发生瞬时自收缩（图2A）。在37℃时，敷料立即收缩，其长径和短径收缩率（d1/d0、h1/h0）分别达到54.48%和55.12%（图2B）。微凝胶尺寸显著影响其自收缩性能：微凝胶尺寸越大，组装体的自收缩速率越慢（支持信息图S6）。此外，该微凝胶组装体能够响应温度变化实现循环自收缩（支持信息图S7）。通过调节羧基-Ca²⁺交联点密度，可精确控制收缩程度。随着钙离子浓度升高，SMARThc敷料在截面EDS能谱中显示出更强的Ca Kα1信号，且其体积收缩率较SMART明显降低（图2C-E；支持信息表S1）。

         考虑到间充质干细胞外泌体具有促进皮肤修复的作用，作者提取hMSCs分泌的外泌体（支持信息图S8）。这些外泌体尺寸分布在30-200 nm范围内（图2F）。通过检测外泌体标志物CD81的表达，同时确认外泌体组分中不含细胞特异性蛋白β-actin（图3G），验证了外泌体的纯度。透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）分别观察到典型的杯状囊泡结构（图2H和2I），证实外泌体成功分离。

         当环境温度低于SMART的低临界溶解温度（LCST）时，微凝胶中酰胺基团与水分子间形成大量氢键。这种相互作用促使SMART发生水合作用并随之体积膨胀，从而促进外泌体向水凝胶内部的扩散和有效装载（图2J）。当温度超过LCST后，氢键网络的破坏引发聚合物链段收缩及SMART整体体积减小，进而实现所载外泌体的释放。

         共聚焦显微镜（CLSM）图像显示，荧光标记的外泌体随时间推移在SMART中实现了均匀分布和成功装载（图2L）。在37℃条件下，虽然前3天呈现持续释放特征，但外泌体可在SMART中保留长达14天，且最终释放率超过90%（图2K,L；支持信息图S9）。值得注意的是，负载外泌体的SMART（SMART-EXO）与空白组表现出相似的力学行为（图2M,N），且其粘度随剪切速率增加呈现近似线性下降趋势（图2O）。

         简言之，本研究开发的SMART系统通过其固有的自收缩特性实现了干细胞外泌体的高效装载与持续释放。更重要的是，外泌体的引入并未影响SMART的整体力学性能。

图2 SMART使外泌体自发加载和持续释放以响应温度变化

3、SMART-EXO敷料通过优异粘附性与原位触发自收缩促进创面闭合

         为实现通过机械刺激促进伤口愈合的应用目标，SMART-EXO敷料需具备足够的组织粘附性。当接触湿润损伤组织时，敷料中的羧基基团能与皮肤组织氨基快速形成氢键，10秒内即可建立稳定粘附（图3A）。该敷料在扭曲、弯曲或冲洗条件下仍能牢固粘附猪皮及心脏组织（图3B），对鸡皮样本在PBS浸泡12小时后仍保持优异粘附强度（图3C）。特别值得注意的是，SMART-EXO能有效粘附于充满模拟肠液（SIF）的损伤猪肠（直径5mm圆形创面）外表面，并通过原位触发自收缩实现创面密封（图3D）。

         定量测试显示，SMART-EXO敷料在猪皮上的剪切强度和创面闭合强度分别超过56 kPa和1.5 N，平均界面韧性达81 J m−2（图3E）。而喷涂生物相容性碳酸氢钠溶液后，界面韧性可降至11.94 J m−2，实现敷料无创移除（图3F）。得益于近体温触发的瞬时自收缩特性，该敷料能主动缩小创面尺寸（图3G）。体外实验表明，在糖尿病小鼠离体皮肤8mm创面模型上，37℃时敷料可使创面长径和短径分别收缩至55.18%和56.58%（图3H）。通过调节羧基-Ca²⁺交联密度，可编程控制收缩程度（支持信息图S11）。例如高钙浓度的SMARThc-EXO可使创面尺寸更温和地缩小至77.1%和74.3%（图3H），这种精确调控能力有望抑制瘢痕过度形成。

         相较于商业敷料产品，SMART-EXO展现出更优异的粘附性能（图3E）[18,31]。其独特的触发式脱附特性避免了传统敷料移除时的二次损伤，特别适用于需要频繁更换敷料的慢性糖尿病创面[32,33]。与静态力学特性的块状水凝胶敷料不同，SMART-EXO基于体积相变温度（VPT）的瞬时响应，能有效诱导湿润损伤组织的机械收缩。通过简单调节交联点密度，即可实现对创面机械收缩程度的程序化编辑。

图3 SMART-EXO具有优异的粘附性，可触发脱离，可编程的皮肤伤口闭合自收缩

4、SMART-EXO敷料通过力学-生化协同作用加速糖尿病创面愈合

         首先评估SMART和SMART-EXO敷料的细胞相容性和血液相容性。与3T3成纤维细胞共培养2天后，活/死染色显示绝大多数细胞保持活性（支持信息图S12A-C）。不同浓度敷料浸提液培养的细胞存活率均超过90%（支持信息图S12D,E），溶血实验显示两组敷料溶血率均低于6%（支持信息图S12F），证实其具有良好的生物相容性。

         为探究机械收缩与外泌体的协同治疗效应，在db/db糖尿病小鼠全层皮肤缺损模型上设置了四组处理：SMART-EXO组（含外泌体的敷料）、SMART组（空白敷料）、EXO组（单纯外泌体悬液）和空白对照组（图4A）。结果显示，SMART-EXO组创面闭合速度最快，第16天时创面面积仅为初始的8.3%±3.20%（图4B,C）。SMART组（37.00%±5.65%）和EXO组（46.16%±13.59%）的促愈合效果均显著优于对照组（68.35%±11.38%），证实机械刺激与生化因子具有协同促进作用。组织学分析显示：第8天时SMART-EXO组表皮厚度达145μm，显著高于其他组（SMART组107μm，EXO组110μm，对照组27μm）（图4D,E）；而到第16天时其表皮厚度变为最薄（图4F），表明愈合过程已进入重塑期。Masson染色显示SMART-EXO组胶原沉积量更多且排列更有序（图4I；支持信息图S13）。免疫荧光检测发现该组CD31（血管标志物）和α-SMA+（肌成纤维细胞标志物）表达量最高（图4G,H,J,K），提示敷料的机械收缩通过调控创面应力促进血管新生和肌成纤维细胞重建[34]。

         值得注意的是，SMART-EXO在II型糖尿病小鼠模型中的治疗效果优于既往报道的多种干预措施[16,18,35-39]。表皮厚度动态变化表明该敷料能有效推动创面从炎症期、增殖期向重塑期转化[40]。在db/db小鼠中，成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化异常会导致创面收缩功能障碍[41,42]，而本研究证实SMART-EXO能通过力学-生化双重作用重建这一转化过程。

         为避免过度机械刺激的不利影响，临床应用时需通过精确调控SMART-EXO的自收缩性能来施加适度机械应力，并定期更换敷料。糖尿病小鼠模型实验结果证实，本研究开发的SMART-EXO敷料能安全有效地加速创面愈合。

图4 SMART-EXO敷料加速糖尿病小鼠伤口愈合

5、SMART-EXO敷料通过激活机械信号转导促进血管新生与上皮再生加速糖尿病创面愈合

         为阐明SMART-EXO调控糖尿病创面修复的分子机制，首先评估了其对关键信号通路的影响。与SMART组相比，第16天时SMART-EXO组创面组织中磷酸化PI3K（p-PI3K）、RAF（p-RAF）、AKT（p-AKT）和Erk1/2（p-Erk1/2）表达显著上调（图5A,B；支持信息图S14），表明外泌体可能通过激活PI3K/AKT和MAPK/Erk通路发挥作用（图5C）。

         通过第16天创面组织的RNA测序分析（支持信息图S15,S16），主成分分析（PCA）显示对照组、SMART组和SMART-EXO组呈现明显不同的转录组特征（图5D）。差异基因分析发现：SMART组与对照组相比有3609个差异基因（2138个上调）；SMART-EXO组与对照组相比有1888个差异基因（1173个上调）；SMART-EXO组与SMART组相比有811个差异基因（410个上调）（图5E-G）。Reactome通路富集分析显示，相较于SMART组，SMART-EXO组显著富集于PI3K/AKT、MAPK和HIF-1等通路（图5H），证实外泌体通过促进细胞增殖、血管生成及炎症调控加速愈合。与对照组相比，SMART-EXO还特异性激活TGF-β/Smad和Hippo等机械信号转导通路（图5I），提示敷料的机械收缩力通过促进成纤维细胞转化、胶原形成及组织发育发挥作用。

         GO分析进一步表明：相较于SMART组，SMART-EXO组差异基因主要富集于细胞增殖、迁移及血管重塑等生物学过程（图5J）；与对照组相比，则显著富集于肌肉收缩调控、肌动蛋白骨架重组、平滑肌发育、上皮细胞迁移、血管内皮迁移及血管生成等功能（图5K）。这些发现共同证明，SMART-EXO敷料通过力学刺激与生化因子的协同作用，从细胞迁移、增殖、血管新生和上皮再生等多维度促进糖尿病创面修复（图6）。

图5 SMART-EXO通过促进细胞迁移、增殖、血管生成和再上皮化来加速糖尿病皮肤伤口愈合

 实验方法：

         水凝胶的制备，外泌体分离和鉴定，傅里叶变换红外光谱，流变学，机械特性，糖尿病小鼠伤口愈合修复动物实验，生物相容性，病理和免疫荧光染色，WB，RT-qPCR

参考文献：

         Xie Q, Yan C, Liu G, Bian L, Zhang K. In Situ Triggered Self-Contraction Bioactive Microgel Assembly Accelerates Diabetic Skin Wound Healing by Activating Mechanotransduction and Biochemical Pathway. Adv Mater. 2024 Sep;36(38):e2406434. doi: 10.1002/adma.202406434. Epub 2024 Jul 23. PMID: 39039968.