年轻成纤维细胞来源的迁移体-老年皮肤创面愈合治疗的手段

         细胞衰老所引发的细胞间通讯改变是皮肤衰老的一个重要因素。迁移体作为一种新发现的囊泡状细胞器，能够高效地参与细胞间通讯；然而，细胞衰老与迁移体之间的关系目前尚未见报道。单细胞RNA测序数据分析显示，在皮肤衰老过程中，成纤维细胞表现出最高的转录变异性，且成纤维细胞的衰老程度与迁移体相关标志物的表达水平呈负相关。进一步的多重免疫组化结果表明，年轻小鼠皮肤中的迁移体数量多于老年小鼠皮肤。透射电子显微镜观察显示，年轻个体皮肤中存在大量迁移体。体外实验表明，与衰老的成纤维细胞相比，年轻成纤维细胞产生的迁移体数量显著更多。从年轻成纤维细胞中纯化的迁移体能够降低HaCaT细胞中衰老相关标志物的表达。在体内实验中，利用自然衰老小鼠的伤口愈合模型，我们观察到来自年轻成纤维细胞的迁移体不仅能够加速伤口愈合，还能降低皮肤中衰老相关标志物的表达。总之，在皮肤衰老的进程中，迁移体的形成能力会降低，而源自年轻成纤维细胞的迁移体能够使衰老的角质形成细胞恢复年轻态，并促进老年皮肤的伤口愈合。这些发现为缓解皮肤衰老以及提升老年皮肤伤口愈合能力提供了新的思路。本文于2025年3月发表于“Journal of Nanobiotechnology”（IF=10.6）上。

技术路线：

结果：

1）在皮肤衰老过程中成纤维细胞表现出最高的转录变异性

         为了描述皮肤衰老过程中各种细胞类型比例和功能的动态变化，我们分析了来自人类样本的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据。我们对包括上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞在内的11种不同的皮肤细胞类型进行了注释（图1A）。为了进一步探究人类皮肤衰老背后的分子变化，我们将与衰老相关的差异表达基因（DEGs）与来自GenAge数据库的衰老和长寿相关基因进行了全面的比较分析。结果显示，在皮肤衰老过程中，成纤维细胞在所有已鉴定的皮肤细胞类型中表现出最高的转录变异性（图1B和C）。因此，在后续的分析中，我们将重点放在成纤维细胞上。

2）ScRNA-seq显示迁移体的形成与细胞衰老呈负相关

         TSPAN4已被确定为迁移体形成的关键促进因子，且TSPAN4的过表达显著增强了迁移体的形成能力。为了探究迁移体与衰老之间的关系，我们从GSE130973中针对TSPAN4基因进行了富集分析。有趣的是，结果显示TSPAN4也主要在成纤维细胞中表达（图2A）。我们提取了成纤维细胞群（图2B），并对成纤维细胞进行了独立分析，结果表明，与迁移体相关的标记物TSPAN4、TSPAN9、CPQ、EOGT、PIGK和NDST1与GenAge数据库中的衰老相关基因呈负相关（图2C）。这些结果表明，成纤维细胞的衰老过程可能会影响迁移体的形成。

3）成纤维细胞衰老可减少迁移体的形成

         为了进一步验证成纤维细胞中迁移体的形成与衰老之间的关系，我们使用来自三只年轻（8周龄）和三只老年（64周龄）C57BL/6J小鼠的皮肤组织进行了多重免疫组化（mIHC）分析。我们使用波形蛋白（Vimentin）标记成纤维细胞，并通过TSPAN4与WGA的共定位来指示迁移体。年轻小鼠的皮肤显示出波形蛋白、TSPAN4和WGA更高的共定位比例，这表明年轻成纤维细胞产生的迁移体更多（图3A）。为了进一步确认皮肤中迁移体的存在，我们使用透射电子显微镜分析了年轻个体的皮肤。我们在真皮乳头层中观察到了显著的迁移体样结构积累（黄色箭头）（图3B）。为了进一步验证成纤维细胞的衰老过程可能会抑制迁移体的形成，我们进行了体外实验。非衰老的成纤维细胞比衰老的成纤维细胞能更显著地形成迁移体（图3C和E），这一结果通过扫描电子显微镜得到了证实（图3D和F）。此外，与迁移体相关的标志物包括EOGT、PIGK和TSPAN4在非衰老的成纤维细胞中显著上调（图3G）。这些发现共同支持了我们的假设，即年轻的成纤维细胞比衰老的成纤维细胞能更有效地产生迁移体。

4）年轻成纤维细胞迁移体缓解HaCaT细胞衰老

         考虑到迁移体主要沉积在表皮-真皮交界处附近，且成纤维细胞与上皮细胞之间的相互作用在皮肤衰老过程中起着关键作用，我们进一步研究了成纤维细胞来源的迁移体对上皮细胞衰老的影响。为此，我们首先从年轻人中提取了成纤维细胞，并通过波形蛋白免疫荧光染色进行了鉴定。随后，我们通过密度梯度离心法纯化了来自年轻成纤维细胞的迁移体（图4A）。纯化后的迁移体呈现出典型的石榴状结构，具有可见的相互连接的收缩纤维结构，直径约为0.5–3微米（图4B）。在纯化的样本中，与迁移体相关的标志物高表达（图4C）。为了探究迁移体是否能被衰老的HaCaT细胞内化，我们将WGA标记的迁移体引入衰老的HaCaT细胞中。结果显示，迁移体在细胞内分散分布（图4D）。随后，我们用不同浓度的成纤维细胞来源的迁移体（2.5、5、7.5和10 μg/ml）处理衰老的HaCaT细胞。来自年轻成纤维细胞的迁移体降低了SA-β-gal阳性细胞的比例（图4E和G）。Western blot显示，迁移体显著降低了H₂O₂诱导的p16和p21表达升高（图4F、H和I）。根据这些结果，我们发现10 μg/ml的浓度效果最佳，因此在后续细胞实验中使用了这一浓度。

5）年轻的成纤维细胞衍生的迁移体促进衰老的HaCaT细胞功能

         我们进一步研究了来自年轻成纤维细胞的迁移体对衰老HaCaT细胞功能的影响。Ki-67免疫荧光染色结果显示，成纤维细胞来源的迁移体增强了衰老HaCaT细胞的增殖活性（图5A和B）。划痕实验（图5C和F）和transwell迁移实验（图5D和G）表明，来自年轻成纤维细胞的迁移体显著提高了衰老HaCaT细胞的迁移能力。考虑到活性氧（ROS）与衰老之间的关联，我们检测了ROS水平。结果显示，迁移体降低了衰老HaCaT细胞中升高的ROS水平（图5E和H）。这些结果表明，成纤维细胞来源的迁移体能够缓解HaCaT细胞的衰老。

6）年轻成纤维细胞衍生的迁移体促进衰老小鼠皮肤伤口愈合

         考虑到衰老会损害受损组织的再生能力以及来自年轻成纤维细胞的迁移体对HaCaT细胞的影响，我们进一步研究了这些迁移体是否也能促进老年皮肤中的伤口愈合。我们建立了一个全层皮肤伤口模型。小鼠被随机分为四组：年轻小鼠组（Y）、老年小鼠对照组（AC）、老年小鼠注射磷酸盐缓冲液（PBS）组（AP）和老年小鼠注射迁移体组（AM）。AP和AM组在伤口周围进行了皮下注射，每处注射25 μg（共四处）。我们在第0、3、5、7和12天对模型进行拍照和记录，并在第12天采集样本（图6A）。观察结果显示，年轻小鼠组的愈合速度显著快于AC和AP组，这凸显了衰老对伤口愈合的不利影响。AP组和AC组之间没有显著差异，但AM组的愈合速度显著快于AC和AP组。有趣的是，在最初的7天内，AM组的愈合能力甚至优于年轻小鼠组，但随后被年轻小鼠组超越。这种现象可能是由于AM组在受伤7天后迁移体被耗尽所致（图6B、C和D）。HE染色显示，AC和AP组的再上皮化过程杂乱无章，而AM组则表现出更优越的再上皮化（图6E）。Masson染色表明，与AC和AP组相比，AM组的真皮厚度增加，胶原纤维形成更多（图6F）。

7）年轻成纤维细胞来源的迁移体减少衰老细胞和SASP

         先前的研究已报道，通过靶向细胞衰老来增强伤口愈合主要涉及减少衰老细胞和衰老相关分泌表型（SASP）。因此，我们通过免疫组化和Western blot探讨了迁移体注射对衰老细胞和SASP的影响。免疫组化分析显示，与AC和AP组相比，AM组和年轻小鼠组（Y）的p21蛋白水平显著降低（图7A和D）。同样，与AC和AP组相比，AM组和Y组的SA-β-gal蛋白水平也显著下调（图7B和E）。相反，与AC和AP组相比，AM组和Y组的Ki-67蛋白水平显著上调（图7C和F）。这些结果表明，注射迁移体显著减少了衰老细胞的数量。我们还检测了促炎细胞因子IL-1β、IL-6和MMP-14。与AC和AP组相比，AM组和Y组的IL-1β、IL-6和MMP-14蛋白水平显著下调（图7G），这表明迁移体可以缓解SASP。

结论：

         本研究揭示了在成纤维细胞衰老和皮肤衰老过程中，迁移体的形成能力显著下降。此外，源自年轻成纤维细胞的迁移体能够使衰老的角质形成细胞恢复活力，并促进老年皮肤的伤口愈合。这些发现为针对皮肤衰老的新疗法开发提供了新颖的见解和方向。

实验方法：

         单细胞测序，迁移体分离，Western blotting，免疫荧光，Transwell，划痕实验，免疫组化。

参考文献：

         Tu H, Shi Y, Guo Y, Zou Z, He Y, Zhou J, He S, Sa G. Young fibroblast-derived migrasomes alleviate keratinocyte senescence and enhance wound healing in aged skin. J Nanobiotechnology. 2025 Mar 11;23(1):200. doi: 10.1186/s12951-025-03293-2.