TRMT6介导的CDK9 mRNA的m1A修饰是HBV相关肝细胞癌的双重致病驱动因子
肝细胞癌（HCC）是全球范围内导致死亡的主要原因之一，其中乙型肝炎病毒（HBV）感染是主要的危险因素。mRNA甲基化的失调参与了肿瘤发生和病毒复制过程。然而，N1-甲基腺嘌呤（m1A）修饰与HCC进展及HBV复制之间的关联尚不明确。本研究通过对4例HCC组织和7例癌旁组织（其中2例来自本研究，5例来自GSE242889数据集）进行单细胞核RNA测序（snRNA-seq），发现HCC组织中mRNA甲基化水平升高，其中m1A“写入器”和“读取器”的表达增加，而m1A“擦除器”的表达降低。在这些分子中，m1A写入器TRMT6在HCC中表达上调，且与患者不良预后相关。敲低TRMT6显著抑制了HCC细胞的恶性表型、致瘤能力以及HBV复制。从机制上看，TRMT6介导的m1A修饰增强了周期蛋白依赖性激酶9（CDK9）mRNA的稳定性和翻译效率。升高的CDK9通过上调其下游致癌效应因子促进HCC进展，并通过使TARDBP蛋白Ser254位点磷酸化，增强pgRNA转录并抑制pgRNA剪接，从而刺激HBV复制。CDK9抑制剂FIT-039可消除这些效应，且无明显毒性。因此，TRMT6介导的m1A修饰双重驱动HCC恶性进展和HBV复制，是一个有前景的治疗靶点，而抑制CDK9可能构成HBV相关HCC的有效治疗策略。本文于2026年4月发表于《Advancedscience》, IF 14.1.
图形摘要
主要实验结果
1. 单细胞核转录组图谱显示HCC组织中m1A修饰水平及TRMT6表达升高
我们对4例HBV阳性HCC组织和2例配对癌旁组织进行了snRNA-seq，并整合了GSE242889数据集中另外5例癌旁组织进行综合分析（图1A）。共计纳入76634个细胞进行后续研究，去除了重复细胞和质量较差的细胞。我们采用统一流形逼近与投影（UMAP）对人群肝细胞群体进行可视化。基于各细胞类型特异性标志物的表达矩阵，我们鉴定出9种主要细胞类型，包括成纤维细胞（FC）、肝细胞（HEP）、内皮细胞（EN）、双细胞（Doubled）、增殖细胞（PC）、髓系细胞（MC）、上皮细胞（EPI）、B细胞（BC）和T/NK细胞（T_NK）。所有细胞类型在肿瘤和对照组织中的比例见图S1F。
图1 通过snRNA-seq分析人HCC及非癌组织鉴定细胞类型
接下来，我们提取了40674个肝细胞进行进一步分析。经过数据降维，我们使用UMAP对人群肝细胞群体进行可视化，并将细胞进一步分为15个亚群（图1B、C）。采用Harmony方法进行数据整合，以去除批次效应并确保一致性和可比性（图1D、E）。根据特异性标志物的表达，细胞被定义为肝细胞和肿瘤细胞（图1F、G）。随后，我们分析了肝细胞和肿瘤细胞中RNA甲基化相关基因集的评分，发现肿瘤细胞中的RNA甲基化水平高于肝细胞（图1H）。为了探讨m1A修饰在HCC中的作用，我们分析了m1A相关分子的基因表达，发现m1A写入器和读取器在肿瘤细胞中的表达高于肝细胞，而擦除器的表达则相反，在肿瘤细胞中低于肝细胞（图1I）。这些结果表明m1A修饰与HCC的发生或进展相关。
为了验证上述结果，我们通过斑点印迹法检测了5对HCC和对照组织中m1A的水平，发现HCC组织中m1A水平显著升高（图1J）。作为主要的m1A写入器，TRMT6在肿瘤细胞中高表达，这与增殖标志物MKI67的表达模式一致（图1K、L）。接下来，我们利用癌症基因组图谱（TCGA）数据库分析了TRMT6的mRNA水平。非配对（图1M）和配对分析均一致显示，与对照组相比，HCC中TRMT6的表达显著升高。我们进一步评估了新鲜冷冻HCC组织、石蜡包埋HCC切片及其对照组织中TRMT6的mRNA和蛋白水平。qRT-PCR（图1N）和免疫组织化学（IHC）（图1O）的结果进一步支持了上述结论。Kaplan-Meier生存分析也表明，TRMT6高表达与HCC患者的不良生存显著相关（图1P）。综合这些数据表明，TRMT6介导的m1A修饰可能在HCC中发挥致癌作用。
2. TRMT6介导的m1A修饰促进HCC细胞的恶性表型
为探究TRMT6介导的m1A修饰对HCC的作用，我们在MHCC97H和Huh7细胞中敲低并异位表达了TRMT6（图2A、B，左图）。TRMT6敲低细胞中m1A水平降低（图2A，右图），而TRMT6过表达细胞中m1A水平升高（图2B，右图），进一步证实了TRMT6对m1A修饰的调控作用。接下来，我们评估了TRMT6对细胞活力的影响。结果显示，敲低TRMT6显著削弱了HCC细胞的增殖能力（图2C）和集落形成能力（图2D）。此外，流式细胞术分析显示，敲低TRMT6后凋亡细胞显著增加（图2E），并且TRMT6敲低明显诱导了G0/G1期细胞周期阻滞（图2F）。Transwell实验表明，敲低TRMT6显著抑制了HCC细胞的迁移和侵袭能力（图2G）。相反，TRMT6过表达则显著增强了细胞的增殖和集落形成能力。
图2 TRMT6介导的m1A修饰增强HCC细胞的恶性行为
为了进一步评估TRMT6介导的m1A修饰对HCC细胞体内致瘤性的影响，我们采用慢病毒系统在MHCC97H细胞中稳定敲低TRMT6，并将TRMT6敲低细胞及其对照细胞皮下接种到裸鼠体内，构建异种移植瘤模型。结果显示，与对照肿瘤相比，来源于TRMT6敲低细胞的异种移植瘤生长更慢（图2H），重量更轻（图2I、J）。此外，移植瘤的Ki-67染色证实了TRMT6敲低细胞的增殖能力下降（图2K）。综上所述，这些数据支持TRMT6介导的m1A修饰在HCC中发挥致癌作用。
3. TRMT6介导的m1A修饰促进HBV复制
HBV感染是HCC的主要危险因素，且HCC的发病率随血清HBV DNA水平升高而增加。考虑到有效的抗病毒治疗可以降低HCC的复发率并改善HBV相关HCC患者的预后，我们试图确定TRMT6介导的m1A修饰在调控HBV复制中的潜在作用。根据HBV感染状态，将细胞分为HBV阳性（HBV+）、HBV阴性（HBV-）和未知（NA）亚组（图3A）。随后我们分析了HBV+和HBV-亚组之间m1A相关调控因子的表达。与HBV-亚组相比，HBV+亚组中大多数m1A写入器和读取器表达上调，而m1A擦除器则呈现相反的表达模式（图3B）。其中，TRMT6在高滴度HBV组织中的表达水平显著高于低滴度HBV组织和癌旁非癌组织（图3C）。我们还分析了新鲜冷冻或石蜡包埋的HBV+ HCC样本及其对照组织中TRMT6的mRNA和蛋白水平。qRT-PCR（图3D）和IHC（图3E）的结果进一步证实TRMT6在HBV+ HCC样本中表达升高。Kaplan-Meier生存分析表明，TRMT6高表达与HBV+ HCC患者的不良预后相关（图3F）。
图3 TRMT6介导的m1A修饰对HBV复制的促进作用
接下来，我们在HepG2.2.15细胞（该细胞基因组中整合了两份头尾相连的HBV DNA序列）中敲低了TRMT6（图3G，左图），并如预期发现，与对照细胞相比，TRMT6敲低细胞中的m1A水平显著降低（图3G，右图）。鉴于pgRNA转录对HBV复制至关重要，甚至决定其复制速率，我们检测了pgRNA和HBV cccDNA的水平，以确定TRMT6敲低对HepG2.2.15和HepAD38细胞中pgRNA转录效率（pgRNA/cccDNA）的影响。结果表明，TRMT6敲低显著降低了pgRNA的表达（图3H，左图），但不影响HBV cccDNA水平（图3H，中图），因此降低了pgRNA的转录效率（图3H，右图）。相反，异位表达TRMT6则提高了pgRNA的转录效率（图3I，右图），表现为pgRNA水平升高（图3I，左图）而HBV cccDNA水平不变（图3I，中图）。此外，TRMT6敲低降低了释放到细胞上清中的病毒颗粒内HBV DNA的含量（图3J），而TRMT6过表达则增加了HBV DNA水平（图3K）。如预期，TRMT6敲低细胞中HBx的mRNA和蛋白水平均显著降低（图3L），而在TRMT6过表达细胞中则升高（图3M）。这些数据表明，TRMT6介导的m1A修饰促进了HBV复制，从而增加了HCC的致癌风险。
4. TRMT6在HCC中上调CDK9的表达
鉴于TRMT6参与mRNA的m1A修饰，我们接下来探究TRMT6是否通过调控主要癌基因mRNA的m1A修饰来促进HCC细胞的恶性表型。为了鉴定受m1A修饰调控的mRNA转录本，我们分析了三个m1A-RIP-seq数据集（这些数据集来自HepG2和HeLa细胞中m1A的全基因组图谱、TRMT6/TRMT61A过表达后积累的m1A位点以及H2O2诱导的m1A峰），以及两个来自YTHDF2和YTHDC1结合m1A位点的PAR-CLIP数据集。结果发现，在所有数据集中均一致鉴定出的基因只有周期蛋白依赖性激酶9（CDK9）和线粒体核糖体蛋白L4（MRPL4）（图4A）。MRPL4是线粒体核糖体的关键组分，但在人类恶性肿瘤（尤其是HCC）中的特征尚不明确。然而，我们观察到敲低TRMT6后，MRPL4的mRNA和蛋白水平均未发生变化。CDK9作为一种典型的转录CDK，已被广泛证实在包括HCC在内的多种恶性肿瘤中具有致癌活性。也有报道称其抑制剂可抑制HBV复制。IHC染色结果显示，与对照组织相比，HCC组织中CDK9的表达升高（图4B），这支持了上述观点。我们使用TCGA数据库进一步验证了这些结果。生存分析显示，CDK9高表达与HCC患者50个月无病生存期缩短显著相关。值得注意的是，这种不良预后相关性在HBV阳性HCC患者中更为显著。
图4 TRMT6上调CDK9表达
我们随后发现，在HCC中CDK9与TRMT6的mRNA表达水平呈显著正相关（图4C）。与之对应的是，在24例石蜡包埋的HCC样本中，CDK9的蛋白水平与定位于细胞质、细胞核及全细胞中的TRMT6均呈正相关（图4D），进一步验证了上述结论。为了确定TRMT6对CDK9的调控作用，我们在MHCC97H、Huh7和HepG2.2.15细胞中敲低TRMT6，发现敲低TRMT6导致CDK9的mRNA（图4E）和蛋白（图4F）水平显著降低，CDK9存在分子量分别为55 kDa和42 kDa的两种亚型。这一观察结果在异种移植瘤组织的CDK9 IHC染色中得到了证实（图4G）。相反，在这些细胞中异位过表达TRMT6则上调了CDK9的mRNA（图4H）和蛋白（图4I）水平。为了排除m6A修饰可能参与调控CDK9表达，我们用METTL3抑制剂STM2457处理MHCC97H、Huh7和HepG2.2.15细胞，结果未能像敲低TRMT6后那样观察到CDK9表达的一致下调。总之，这些数据表明TRMT6可能以m1A依赖的方式调控CDK9表达。
5.TRMT6介导的CDK9 mRNA的m1A修饰增强其稳定性和翻译效率
接下来，我们使用RMBase v2.0数据库（https://rna.sysu.edu.cn/rmbase/m1Amod.php）预测了CDK9 mRNA中的m1A基序，并在其编码DNA序列（CDS）中发现了一个m1A基序“GTTCGA”（图5A）。甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）结合qRCR（MeRIP-qPCR）可用于检测m1A修饰水平。为此，我们首先设计了两对引物，分别检测CDK9 mRNA中m1A上游序列“U”和包含m1A的序列“M”（图5B）。MeRIP-qPCR结果显示，在MHCC97H、Huh7和HepG2.2.15细胞中异位表达TRMT6显著增加了m1A水平（图5C）。
图5 TRMT6介导的m1A修饰增强CDK9 mRNA的稳定性和翻译效率
RNA甲基化修饰（如m6A和m1A）通常影响mRNA的稳定性和翻译效率。因此，我们用10 µM放线菌素D（ACTD）处理TRMT6敲低或过表达的MHCC97H、Huh7和HepG2.2.15细胞及其对照细胞，以抑制mRNA转录，然后评估它们对CDK9 mRNA稳定性的影响。结果表明，与对照相比，敲低TRMT6显著加速了CDK9 mRNA的降解（图5D），而TRMT6过表达则增强了CDK9 mRNA的稳定性（图5E）。我们还基于pCI-neo载体构建了包含野生型m1A基序（GTTCGA）或点突变型m1A基序（GTTCGT）的荧光素酶报告质粒（图5F，上图），分别命名为CDK9-WT和CDK9-T39A。结果显示，TRMT6过表达显著增加了CDK9-WT报告质粒的萤火虫荧光素酶强度（图5F，中图），而CDK9-T39A则显著减弱了这一效应（图5F，下图），表明m1A修饰促进了CDK9 mRNA的翻译。与之相符的是，我们通过多聚体谱分析证明，在MHCC97H、Huh7和HepG2.2.15细胞中敲低TRMT6显著降低了CDK9 mRNA在多聚体层中的分布（图5G）。接下来，我们通过siRNA介导的敲低筛选了多个已知的m1A读取器。结果显示，在所检测的三个细胞系中，这些已知读取器均未显著调控CDK9的mRNA或蛋白水平。这些结果使我们合理推断，介导CDK9调控的m1A读取器可能不在目前已鉴定的读取器之中，而可能是一种在mRNA稳定性和翻译调控中具有双重作用的新型读取器。综上所述，这些数据表明，TRMT6介导的CDK9 mRNA的m1A修饰增强了其稳定性和翻译效率。
6.抑制CDK9可消除TRMT6对HCC细胞恶性行为及HBV复制的促进作用
为了进一步明确TRMT6介导的mRNA m1A修饰通过上调CDK9在HCC中发挥的致癌功能，我们首先用选择性CDK9抑制剂FIT-039处理MHCC97H和Huh7细胞，结果显示FIT-039在MHCC97H细胞中的IC50值为22.13 µM，在Huh7细胞中为13.93 µM。同时，我们观察到FIT-039处理显著逆转了TRMT6过表达所诱导的促增殖和促集落形成效应（图6A、B）。一致地，在过表达TRMT6的MHCC97H和Huh7细胞中敲低CDK9同样减弱了TRMT6对细胞增殖和集落形成的增强作用。此外，FIT-039处理和CDK9沉默均能有效消除TRMT6过表达对细胞凋亡的抑制作用（图6C）。
图6 TRMT6介导的CDK9上调促进HCC细胞的恶性表型及HBV复制
为了进一步研究TRMT6介导的CDK9上调对HCC细胞体内致瘤性的影响，我们利用慢病毒系统在MHCC97H细胞中稳定过表达TRMT6，并将TRMT6过表达细胞及其对照细胞皮下接种到裸鼠体内。随后，对携带TRMT6过表达细胞来源异种移植瘤的小鼠给予150 mg/kg FIT-039或等剂量的DMSO。结果显示，与对照肿瘤相比，TRMT6过表达细胞来源的异种移植瘤生长更快、重量更大，而FIT-039可有效逆转这一现象（图6D、E）。上述肿瘤中核增殖标志物Ki-67的IHC染色支持了这一结果（图6F）。此外，在整个治疗期间，各实验组之间的小鼠体重未见显著差异。同样，这些小鼠的血清标志物以及肝、肾功能的组织形态学也未发生变化。总之，这些结果表明FIT-039给药不会引起明显毒性。
为了提高我们研究结果的临床相关性和转化潜力，我们通过将人HCC组织皮下植入NCG小鼠体内构建了HCC患者来源异种移植模型（PDX），并通过瘤内注射腺相关病毒（AAV）过表达TRMT6。随后，通过腹腔注射给予荷瘤小鼠150 mg/kg FIT-039或等剂量的DMSO（图6G）。结果显示，在PDX模型中，药物抑制CDK9显著抑制了肿瘤生长，表现为肿瘤体积和重量减小（图6H、I）。Ki-67的IHC染色进一步支持了上述结果（图6J）。在整个治疗期间，所有实验组的小鼠体重保持相当。此外，血清生化指标以及肝脏和肾脏切片的H&E染色表明，FIT-039治疗未引起明显毒性。
接下来，我们用10 µM FIT-039处理过表达TRMT6的HepG2.2.15细胞，以评估其对HBV复制的影响。同时，在过表达TRMT6的HepAD38细胞中敲低CDK9，以排除FIT-039的潜在脱靶效应。结果显示，FIT-039和CDK9沉默均有效逆转了TRMT6介导的pgRNA转录效率升高（图6K，右图），表现为pgRNA水平恢复（图6K，左图）而cccDNA水平不变（图6K，中图）。此外，FIT-039或CDK9敲低同样能够消除TRMT6过表达对HBV DNA（图6L）和HBx（图6M）水平的刺激作用。综上所述，我们的研究结果支持TRMT6介导的m1A修饰通过上调CDK9促进HCC进展和HBV复制，凸显了它们作为HBV相关HCC治疗靶点的潜力。
7. CDK9通过上调其下游致癌效应因子增强HCC细胞的恶性表型
作为一种丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）激酶，CDK9通过上调关键的下游效应因子发挥其致癌活性。因此，我们在MHCC97H、Huh7和HepG2.2.15细胞中研究了沉默或过表达TRMT6对CDK9关键致癌下游靶点水平的影响，这些靶点包括磷酸化的STAT3（p-STAT3）、MCL1和BCL-2，它们被广泛认为是HCC发病机制中的关键介质。结果如预期所示，敲低TRMT6显著降低了这些致癌蛋白的水平（图7A），这一结果在TRMT6敲低异种移植瘤和对照肿瘤的IHC染色中得到了进一步验证（图7B）。相反，过表达TRMT6提高了p-STAT3、MCL1和BCL-2的水平（图7C），而这一效应可被FIT-039和CDK9敲低所逆转（图7D）。这些观察结果在来自图6E、I的异种移植瘤中这些分子的IHC染色中得到了进一步证实（图7E）。这些数据共同表明，TRMT6介导的CDK9上调通过激活其核心促肿瘤下游效应因子来驱动HCC进展。
图7 TRMT6通过CDK9介导的致癌效应因子上调在HCC中发挥致癌作用
8. CDK9通过磷酸化TARDBP的Ser254位点促进HBV复制
尽管抑制CDK9可以阻碍HBV复制，但其潜在的分子机制仍不明确。鉴于CDK9主要通过与底物蛋白相互作用并使其磷酸化来发挥激酶功能，我们在HepG2.2.15和HepG2细胞中进行了免疫共沉淀（Co-IP）联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，以鉴定潜在的CDK9底物。对HepG2.2.15细胞中候选蛋白的基因本体论（GO）分析揭示了15个与病毒过程和生命周期相关的条目。通过比较HepG2.2.15和HepG2细胞之间的差异独特肽段，我们进一步分析了参与病毒过程的表达上调和下调的前10个分子。其中，TAR DNA结合蛋白（TARDBP，也称TDP-43）是一种核DNA/RNA结合蛋白，参与mRNA转录、剪接、稳定性和翻译调控，此前已发现与HBV复制相关。LC-MS/MS鉴定出的其肽段序列见图S28。因此，选择TARDBP用于后续实验的深入机制研究。
我们首先通过癌症基因组图谱（TCGA）数据库分析了TARDBP的mRNA水平，结果显示与对照组织相比，HCC组织中TARDBP的表达显著升高。随后的生存分析表明，TARDBP表达升高与HCC患者的不良临床结局密切相关，且这种关联在HBV阳性HCC病例中更为显著（图8A）。此外，我们通过反向Co-IP实验验证了HepG2.2.15细胞中CDK9与TARDBP之间的相互作用（图8B）。接下来，我们利用CRISPR-Cas9系统在HepG2.2.15和HepG2 NTCP细胞中敲除了TARDBP。HepG2 NTCP细胞是通过在HepG2细胞中异位表达NTCP建立的，TARDBP成功缺失的验证见图S30C。敲除TARDBP导致pgRNA水平显著降低（图8C）。此外，过表达CDK9（图8D）或TRMT6（图8E）在对照细胞中显著提高了pgRNA水平，但在TARDBP缺陷细胞中则无此效应，这支持了TRMT6–CDK9轴通过TARDBP促进HBV复制的模型。
图8 CDK9通过磷酸化TARDBP的Ser254位点促进HBV复制
接下来，我们研究了CDK9如何通过TARDBP调控HBV复制。鉴于其激酶活性，我们假设CDK9直接磷酸化作为底物的TARDBP。为了验证这一点，我们用CDK9抑制剂FIT-039或DMSO处理HepG2.2.15细胞，然后通过Co-IP联合LC-MS/MS鉴定受CDK9调控的TARDBP磷酸化位点。结果显示，FIT-039显著降低了TARDBP在多个丝氨酸残基（包括Ser254）上的磷酸化水平（图8F）。体外激酶实验进一步证实，CDK9直接磷酸化TARDBP的Ser254位点，而S254A突变体则消除了这一修饰。TARDBP的RRM2结构域（第192–265位氨基酸）可与HBV核心启动子（CP）结合，这对pgRNA转录至关重要，且Ser254位点对TARDBP的RNA结合亲和力具有关键作用。综上所述，这些发现提示TARDBP Ser254磷酸化可能促进HBV复制。
为了验证上述假设，我们构建了野生型TARDBP（TARDBP-WT）及其磷酸化模拟突变体（S254E）和磷酸化缺陷突变体（S254A），每个突变体在sgTARDBP识别序列内均携带同义密码子突变。然后将这些构建体转染到TARDBP敲除的HepG2.2.15和HepG2 NTCP细胞中，并评估它们对HBV复制的影响。结果显示，与TARDBP-WT相比，TARDBP S254E显著增加了pgRNA水平，而与TARDBP S254E相比，TARDBP S254A则显著降低了pgRNA丰度（图8G，左图）。两种突变体均未改变cccDNA水平（图8G，中图），它们对pgRNA转录效率的影响与其对pgRNA水平的影响一致（图8G，右图）。同样，与TARDBP-WT相比，TARDBP S254E显著提高了HBV DNA和HBx的水平，而TARDBP S254A则消除了这些效应（图8H）。为了进一步验证这些结果，我们在TARDBP敲除的HepG2.2.15细胞中异位表达TRMT6，并同时加入10 µM FIT-039。结果表明，TARDBP WT提高了pgRNA和HBV DNA的水平，TARDBP S254E进一步增强而TARDBP S254A减弱了这些效应（图8I、J）。值得注意的是，在FIT-039处理后，仅有TARDBP S254E仍保留强烈促进pgRNA和HBV DNA水平的能力（图8I、J）。这些数据表明，CDK9介导的TARDBP Ser254磷酸化促进了HBV复制。
9. TARDBP Ser254磷酸化激活HBV核心启动子并抑制pgRNA剪接
基于上述发现，我们推测TARDBP Ser254磷酸化可能通过增强核心启动子（CP）活性和抑制pgRNA剪接来促进HBV复制。为了验证这一点，在TARDBP敲除的HepG2.2.15和HepG2-NTCP细胞中异位表达TARDBP-WT、-S254E和-S254A，然后使用含有HBV CP区域（nt1613–nt1849）的双荧光素酶报告基因检测CP活性。结果显示，与TARDBP-WT相比，TARDBP-S254E显著增强了萤火虫荧光素酶强度，而与TARDBP-S254E相比，TARDBP-S254A则显著降低了该强度（图8K）。ChIP-qPCR实验进一步证实，TARDBP-S254E与HBV CP的结合增强，而TARDBP-S254A则显著减弱了这种结合（图8L）。鉴于已知TARDBP可调控pgRNA剪接，我们通过在TARDBP敲除的HepG2.2.15和HepG2-NTCP细胞中异位表达TARDBP-WT、-S254E和-S254A，检测了TARDBP S254磷酸化对野生型（Wt）和缺失1.3 kb内含子的2.2 kb剪接变体（Sp）pgRNA水平及比例的影响。结果显示，与TARDBP-WT相比，TARDBP-S254E显著提高了pgRNA中Wt的比例并降低了Sp的比例，而TARDBP-S254A则显著减弱了这一效应（图8M）。接下来，我们在TARDBP敲除细胞中异位表达TRMT6，并用FIT-039处理这些细胞，评估它们对HBV CP活性和pgRNA剪接的影响。与对照组相比，TARDBP-WT显著增加了萤火虫荧光素酶强度（图8N）和Wt pgRNA的比例（图8O），TARDBP-S254E进一步增强而TARDBP-S254A则显著降低了这一效应。综上所述，这些结果证明TRMT6-CDK9轴驱动TARDBP Ser254磷酸化，从而通过刺激pgRNA转录和抑制pgRNA剪接来促进HBV复制。
通过总结上述发现，我们阐明了TRMT6介导的m1A修饰通过上调CDK9促进HCC进展和HBV复制的机制。具体而言，TRMT6表达增加通过m1A修饰增强CDK9 mRNA的稳定性和翻译效率，从而上调其表达。CDK9一方面通过上调其下游致癌效应因子（如p-STAT3、MCL1和BCL-2）的水平促进HCC细胞的恶性表型；另一方面，CDK9通过磷酸化TARDBP的Ser254位点，激活HBV CP以促进pgRNA转录，并抑制pgRNA剪接，从而促进HBV复制并增加HCC的风险。
参考文献：
Zhang R, Zong D, Liu R, Wang Y, Gu Q, Yao Y, Zheng W, Yuan M, Wang S, Cui R, Li D, Dang S, Hou P. TRMT6-Mediated m1A Modification of CDK9 mRNA Is a Dual-Pronged Pathogenic Driver for HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. Adv Sci (Weinh). 2026 Apr 20:e14172. doi: 10.1002/advs.202514172. Epub ahead of print. PMID: 42003777.