高分文章揭示细胞核circRNA新机制
高分文章揭示细胞核circRNA新机制
很多人都会有这样的疑问， circRNA定位在细胞核中吗？其实，环状RNA（Circular RNA, CircRNA）主要在细胞浆中富集，只有少数定位于细胞核。目前文章报道的circRNA 主要定位于细胞质中，通过ceRNA机制发挥作用。那么细胞核中的circRNA 又具有什么功能呢？4月3日，知名免疫杂志Immunity （IF=22.8）发表了中科院生物物理所范祖森教授课题组的文章，首次报道 circRNA Cia-cGAS（作者以结合的蛋白命名）定位于细胞核中，通过结合cGAMP合成酶cGAS并抑制其酶活性，降低IFNs表达，维护静息状态的长效造血干细胞（LT-HSC）免受耗竭。（文章题目：A Circular RNA Protects Dormant Hematopoietic Stem Cells from DNA Sensor cGAS-Mediated Exhaustion）。
成人造血干细胞（HSC）在骨髓内多以静息状态存在，同时保持着自我更新和分化的潜能，自我更新与分化稳态的破坏会导致骨髓衰竭或血液恶性肿瘤。长期造血干细胞（Long-term HSCs , LT-HSCs）作为潜能最高的干细胞系，为短期造血干细胞（ST-HSC）、多能干细胞（MPP）等祖细胞提供了持续性细胞补给。然而，HSCs如何维持其静息状态，并避免I型干扰素(IFN)介导的衰竭尚未清楚。
研究路线：
1确定目标circRNA
为研究circRNAs对HSCs自我更新的影响，作者采用小鼠circRNA芯片在LT-HSCs 和MPPs两种细胞中筛选差异表达circRNA，结果发现49个circRNA 在LT-HSCs中上调 （A），RT-PCR验证到9个上调circRNA (B)；northern blot鉴定这些circRNA (C)后， 进一步将这9个circRNA对应的 shRNAs 慢病毒移植小鼠发现只有Cia-cGAS影响HSCs的亚群分布 (D,E,F,G)，同时确定干扰母基因线性RNA并无明显表型。接下来就是在小鼠不同组织，不同类型细胞中通过northern blot 和RT-PCR（一对convergent引物、一对divergent引物）验证Cia-cGAS的存在性，普遍性和保守性 (H,I,J)。并通过FISH和核质分离PCR发现Cia-cGAS位于细胞核中(K,L),其对应线性RNA位于细胞质而(附图)。
2.Cia-cGAS具有哪些功能？（维持LT-HSCs的静息状态）
作者通过迷你系统迷你基因载验证Cia-cGAS序列上下游内含子中的反向互补序列是成环的关键，因此在内含子反向互补序列处设计引物，通过CRISPR/Cas9在小鼠内进行Cia-cGAS敲除 （A,B,C）。分离小鼠骨髓HSC细胞通过流式确定敲除Cia-cGAS后LT-HSCs细胞数和百分比下降(D,E,F)，且成熟的造血细胞数量也下降(H)，骨髓切片HE染色发现有核细胞减少(G)。同时BrdU腹腔注射小鼠后流式分析LT-HSCs的BrdU信号，发现Cia-cGAS敲除后BrdU信号增强(I)；细胞周期分析LT-HSCs表明现，Cia-cGAS敲除处于S/G2/M活跃状态的后LT-HSCs细胞数增多 (J)。这些结果表明Cia-cGAS维持LT-HSCs的静息状态。
3.Cia-cGAS通过哪些基因调控LT-HSCs的静息状态 ？（IFN）
确定circRNA 功能后，接下来作者研究其作用机制。通过mRNA芯片在cia-cGAS+/+ 和cia-cGAS–/– LT-HSCs中筛选差异表达基因(A)。筛选上调的已报道调控HSC活跃状态的IFN。并通过PCR 和ELISA 验证IFN的表达（B,C）. 通过回复实验，确定IFN敲除 后能回复cia-cGAS敲除造成的静息破坏（E,F,G,H）
4.Cia-cGAS通过什么机制调控IFN? (结合蛋白cGAS)
因为Cia-cGAS位于细胞核中，所以其可能通过结合蛋白（如：酶类，转录因子）来调控mRNA的合成。作者以Cia-cGAS对应的线性RNA为探针进行RNA pull down,通过质谱筛选拉下的蛋白（A），筛选到已报道通过合成GAMP, 而调控IFN 的合成酶cGAS。进一步，通过特异抗体WB 和RIP验证（B,C）. 接下来确定Cia-cGAS和cGAS共定位：免疫荧光，质分离WB,和免疫荧光共定位（D,E,F）. 进一步确定结合位点：生物信息学分析Cia-cGAS对应线性RNA的二级结构（G）, 位点突变后进行EMSA 和AlphaScreen （H,I,J,K）
5.Cia-cGAS 对结合蛋白的调控？ （抑制其酶活性）
cGAS 通过结合DNA，催化cGAMP合成。因此作者研究Cia-cGAS结合cGAS对其结合DNA能力的影响。通过竞争性EMSA试验，对cGAS孵育不同量的Cia-cGAS看其结合DNA 的能力变化（A）,并反面验证（B）; 同时用RNA pull down 和DNA pull down 验证 （C,D）。通过TLC，ChIP， reverse phase-HPLC，luciferase assay 验证Cia-cGAS敲除对cGAMP合成的影响 （E,F,G,H）.
6.Cia- cGAS /结合蛋白/靶基因 对LT-HSCs静息状态和免疫的调控
最后就是调控通路回到细胞表型上，通过回复性试验进行验证。联合敲除Cia-Cgas/和结合蛋白后，实验方法跟功能研究实验一样。
7.Cia- cGAS作用机制图
