脂肪细胞衍生的外泌体miR-27a通过抑制PPARγ在骨骼肌中诱导胰岛素抵抗
Theranostics: 脂肪细胞衍生的外泌体miR-27a通过抑制PPARγ在骨骼肌中诱导胰岛素抵抗
脂肪细胞衍生的内分泌因素促进骨骼肌胰岛素抵抗的机制尚未完全了解。miR-27a在前驱糖尿病和T2DM肥胖患者的血清中高度表达，主要由脂肪组织衍生。因此，由脂肪组织分泌到循环中的miR-27a可以调节骨骼肌中的胰岛素抵抗。近日，发表在《Theranostics》（IF:8.766）的文章《Adipocyte-Derived Exosomal MiR-27a Induces Insulin Resistance in Skeletal Muscle Through Repression of PPARγ》探究了在肥胖幼年高脂饮食诱导的miR-27a敲减肥胖小鼠，db/db小鼠和过表达miR-27a的C2C12细胞中miR-27a与骨骼肌胰岛素抵抗之间的关联。通过棕榈酸酯处理的3T3-L1脂肪细胞制备的条件培养基孵育C2C12细胞来测定外泌体miR-27a介导的脂肪组织和骨骼肌之间的信号通讯。研究人员发现肥胖幼年小鼠血清miR-27a水平与肥胖和胰岛素抵抗呈正相关，并且血清miR-27a水平与瘦素受体缺陷型db/db小鼠的胰岛素抵抗和肥胖和胰岛素抵抗相关，同时与高脂饮食喂养的C57BL/6J小鼠肥胖和胰岛素抵抗相关。从高脂饮食喂养的C57BL/6J小鼠的脂肪细胞释放的miR-27a与甘油三酯积累有关。来源于这些脂肪细胞的miR-27a通过miR-27a介导的对PPARγ及其下游基因的抑制来参与肥胖发展，在C2C12骨骼肌细胞中诱导胰岛素抵抗。
技术路线
实验结果
1、 血清中miR-27a水平与肥胖诱导的胰岛素抵抗有关
图一 血清miR-27a与肥胖儿童进行性全身胰岛素抵抗有关，并且在高脂饮食喂养的小鼠和db / db（瘦素受体缺陷型）小鼠中血清miR-27a水平升高。
A) 肥胖（OB）和正常体重（NW）儿童的血清中的miR-27a水平，miR-27a在肥胖儿童的血清中升高；
B）血清miR-27a水平与BMI之间的相关性；
C）血清miR-27a水平与空腹血糖之间的相关性；
D）HF（高脂饮食）和LF（低脂饮食）喂养的小鼠2、4、8和12周时体脂肪分布百分比；
E）HF和LF组血清中miR-27a的相对表达；
F）HF组和LF组OGTT（口服葡萄糖耐量试验）曲线下面积；
G）HF组和LF组ITT（胰岛素耐量试验）曲线下面积；
I）db / db小鼠的Lee’s指数显著高于db / m小鼠；
J）db / db小鼠的空腹血糖显著高于db / m小鼠；
K）db / db小鼠血清中miR-27a的相对表达显著高于db / m小鼠；
L）db / m和db / db小鼠的OGTT曲线下面积。
图二 在高脂饮食喂养的小鼠中，敲减miR-27a降低了血清miR-27a水平并且改善了葡萄糖和胰岛素耐受性，但是不提高体脂肪百分比分布。
A）低脂饮食+空载体小鼠（LF + EV），高脂饮食+空载体小鼠（HF + EV）和高脂饮食+ miR-27a敲减小鼠的脂肪百分比；
B）各组血清miR-27a的相对表达，其中高脂饮食+空载体小鼠表达量最高；
C）各组OGTT曲线下面积，与LF+EV组相比，HF+EV和HF+miR-27a(-)都更高；
D）各组ITT曲线下面积，与HF+EV相比，HF+EV和HF+miR-27a(-)显著升高。
2、 MiR-27a通过PPARγ抑制作用损害骨骼肌中的胰岛素信号传导
图三 miR-27a促进骨骼肌中的胰岛素抵抗。
A）第2、4、8、12周LF和HF小鼠骨骼肌中的miR-27a水平；
B）12周时LF和HF小鼠中IRS-1，Akt和GLUT4的mRNA表达；
C）12周时用胰岛素处理（+）或未处理（-）的LF和HF小鼠骨骼肌中p-IRS-1，IRS-1，p-Akt，Akt和GAPDH的蛋白质表达；
D）LF + EV，HF + EV和HF + miR-27a（-）小鼠骨骼肌中miR-27a水平；
E）LF + EV，HF + EV和HF + miR-27a（-）小鼠中IRS-1，Akt和GLUT4的mRNA表达；
F）LF + EV，HF + EV和HF + miR-27a（-）小鼠骨骼肌中p-IRS-1，IRS-1，p-Akt，Akt和GAPDH的蛋白质表达。
图四 miR-27a通过靶向PPARγ来减少C2C12细胞中的葡萄糖消耗。
A）对照（黑色），miR-27a（+）（空白），miR-27a +罗格列酮（灰色）和罗格列酮（阴影）C2C12细胞中miR-27a的表达；
B）上述C2C12细胞中的葡萄糖消耗；
C）用（+）或不用（-）100nM胰岛素温育30分钟的上述C2C12细胞中的葡萄糖摄取。与与对照相比，胰岛素刺激未能增加miR-27a（+）细胞中的葡萄糖摄取；
D）通过预测靶扫描，mmu-miR-27a-3p和PPARγ3'UTR的318-325位的序列互补；
E）miR-27a和PPARγ的荧光素酶报道试验结果显示，miR-27a通过与野生型PPARγ3'UTR序列结合显著降低荧光素酶密度，而突变型PPARγ3'UTR没有发现减少。
图五 miR-27a通过PPARγ抑制作用损害骨骼肌中胰岛素介导的信号转导。
A-C）PPARγ在12周LF和HF小鼠骨骼肌中的mRNA和蛋白质表达，与LF小鼠相比，HF小鼠骨骼肌中PPARγ的mRNA和蛋白质表达较低；
D-F）LF + EV，HF + EV和HF + miR-27a（-）小鼠骨骼肌中PPARγ的mRNA和蛋白表达，HF小鼠中miR-27a敲减增加了PPARγ的mRNA和蛋白质表达；
G-J）罗格列酮治疗部分增加过表达miR-27a的细胞中的PPARγmRNA和蛋白质表达；
K-L）罗格列酮治疗增加了过表达miR-27a的细胞中胰岛素刺激的p-IRS-1蛋白及其下游p-Akt蛋白表达。
3、 负载脂质的脂肪细胞（但不是巨噬细胞）会将miR-27a分泌到外泌体中
图六 HF饮食喂养的小鼠的脂肪细胞释放miR-27a，棕榈酸酯处理的3T3-L1脂肪细胞分泌miR-27a。
A）LF和HF小鼠在2,4,8和12周的内脏脂肪组织中miR-27a的相对表达，与LF喂养的小鼠相比，喂食高脂肪饮食2周的小鼠的内脏脂肪组织中的MiR-27a表达增加；
B）db / m和db / db小鼠的内脏脂肪组织中miR-27a的相对表达，与db / m小鼠相比，db / db小鼠在内脏脂肪中表现出miR-27a的较低表达；
C）LF + EV，HF + EV和HF + miR-27a（-）小鼠的内脏脂肪组织中的miR-27a水平，在喂食HF的小鼠中miR-27a敲减导致内脏脂肪组织中miR-27a水平降低；
D-F）与对照（Con）相比，在棕榈酸盐处理的细胞（Pal）中观察到脂质积累的增加, TAG浓度也增加；
G）与对照相比，棕榈酸酯处理的3T3-L1细胞中的miR-27a表达较低；
H）棕榈酸盐处理的细胞上清液中miR-27a水平比对照细胞高2.7倍。
图七 负载脂质的脂肪细胞衍生的miR-27a在外泌体中分泌。
A）在2,4,8和12周的LF和HF小鼠的血清中的FABP4浓度；
B -C）与LF小鼠相比，血清外泌体为FABP4阳性，并且来自HF小鼠血清的这些外泌体中的miR-27a积累较高；
D）从对照或棕榈酸处理的表达miR-27a的3T3-L1细胞上清液中提取的外泌体中的MiR-27a水平。与对照相比，用棕榈酸酯处理3T3-L1细胞将miR-27a释放到上清液中；
E）在用棕榈酸盐处理的过表达miR-27a的3T3-L1细胞的上清液中，miR-27a与FABP4共定位；
F）在不存在或存在0.3mM棕榈酸酯的情况下温育48小时的来自3T3细胞的外泌体的扫描电子显微照片；
G）外泌体标记物CD63存在上述细胞中；
H）上述细胞外泌体中miR-27a的表达，棕榈酸酯处理后表达增强。
4、 脂肪细胞衍生的外泌体miR-27a被C2C12骨骼肌细胞摄取
图八 C2C12细胞摄取脂肪细胞分泌的外泌体miR-27a。
A）与LF小鼠相比，HF的骨骼肌裂解物中FABP4蛋白的表达增加；
B）在C2C12细胞与CM1（对照）或CM2（棕榈酸酯处理）培养基孵育48小时后，上清液中的FABP4降低；
C）与CM1或CM2孵育后C2C12细胞中的FABP4浓度；
D）在C2C12细胞与CM1或CM2培养基孵育48小时后，上清液中miR-27a水平降低；
E）在用对照或棕榈酸处理的3T3-L1细胞（其中miR-27a被敲除）制备的条件培养基中，与CM1相比，CM2孵育的C2C12细胞中miR-27a水平升高；
F）与对照相比，用棕榈酸酯处理的脂肪细胞的上清液孵育的C2C12中的荧光强度更大。
5、 脂肪细胞衍生的miR-27a在骨骼肌细胞中积累，并且通过阻抑PPARγ而损害胰岛素信号传导
图九 脂肪细胞衍生的miR-27a增加miR-27a，并且损害C2C12细胞中的胰岛素信号传导。
A-B）与CM1处理的细胞相比，CM2处理的C2C12细胞的葡萄糖消耗，葡萄糖摄取和胰岛素刺激的葡萄糖摄取降低；
C-D）与CM1组相比，CM2组中观察到PPARγmRNA和蛋白质水平的明显降低，CM1组通过CM2组中的miR-27a敲减而恢复；
E-F）与CM1处理的细胞相比，CM2处理的C2C12细胞中PPARγ，IRS-1和GLUT4mRNA表达降低，并且胰岛素刺激的p-IRS-1和p-AKT降低。
结论
综上所述，这些结果确定了脂肪组织和骨骼肌之间在胰岛素抵抗发展过程中的新型交叉通讯信号通路，并且表明脂肪组织来源的miR-27a可能在肥胖引发的骨骼肌胰岛素抵抗发生中起关键作用。