Exosome research: 外泌体介导的lncRUNX2-AS1从多发性骨髓瘤细胞到间充质干细胞的转移对成骨的抑制作用

多发性骨髓瘤（MM）的特征是间充质干细胞（MSC）的成骨能力降低。癌细胞和癌症基质细胞之间的交流是肿瘤进展的驱动因素。了解骨髓瘤-基质的相互作用对于开发可逆转骨疾病的有效策略至关重要。近日，发表在《Oncogene》（IF=6.854）上的文章《Exosome-mediated transfer of lncRUNX2-AS1 from multiple myeloma cells to MSCs contributes to osteogenesis》报道了外泌体在MM患者骨形成抑制中的作用。他们发现在骨髓瘤细胞中有生物活性的lncRNA RUNX2-AS1可以被包装到外泌体中并传递给MSC，从而抑制MSC的成骨。RUNX2的反义链RUNX2-AS1在MM患者的MSCs中富集。RUNX2-AS1能够在互补区域与RUNX2 前体mRNA形成RNA双链体，并通过降低剪接效率而转录抑制RUNX2表达，导致MSC的成骨潜能下降，体外小鼠模型施用外泌体分泌抑制剂GW4869可有效预骨丢失。

技术路线

研究结果

1. MM细胞衍生的外泌体被转移至MSC。

图1 来自人骨髓瘤细胞系（HMCL）的外泌体的表征

a. MM1S分泌的外泌体的典型TEM成像（Bar = 100nm）。b. 动态光散射测量U266分泌的外泌体。c. HSP70衍生的外泌体中HSP70和flotillin-1蛋白的典型western blot。d. 在缺乏（对照）或存在U266衍生的PKH67标记的外泌体的情况下培养BM-MSC 24小时。外泌体被BM-MSC摄取了，如共聚焦显微镜（原始放大倍数，×400）所示，DAPI（细胞核）和594缀合的抗肌动蛋白抗体对MSC进行染色。e. 用荧光标记的外泌体孵育后的MSC的流式细胞术分析。FL1荧光表明外泌体摄取。

2. MM衍生的外泌体在MSC成骨分化中的作用。

图2 U266衍生的外泌体对ND-MSCs1成骨分化的影响

a.b. 外泌体衍生自U266。外泌体分离后剩余的上清液。外泌体从含无外泌体的胎牛血清的培养基中培养48h的U266中分离。以U266的上清、从U266分泌的外泌体、外泌体缺失的上清或PBS培养一定时期的ND-MSCs1中矿化瘤的Von Kossa染色a和茜素红染色b。转染了从U266的外泌体中提取的总RNA，大RNA或小RNA的ND-MSCs1中矿化瘤的Von Kossa染色c和茜素红染色d。

3. 外泌体介导lncRNA RUNX2-AS1从MM细胞转移到MSC的成骨抑制作用。

图3 参与外泌体介导的成骨分化减少的mRNA的鉴定

a. 特异性基线基因表达特征与成骨分化活性相关。典型GSEA图解说明：MM-MSC的转录物中参与成骨分化的正调控或负调控基因的丰度。FDR：错误发现率，NES标准丰度得分。b. MM-MSC和NDMSCs的基因表达谱。在关于成骨分化的基因组中的MM-MSC中下调（蓝色）的前50个基因。c. 特定样品中筛选失调基因的流程图。

图4 外泌体lncRNA RUNX2-AS1及其对成骨分化影响的鉴定

a. 特定样品中筛选失调基因的流程图。b. 通过MM-MSC和ND-MSC的高通量测序数据进行的lncRNA分析的热图。c. 对照、RUNX2- AS1过表达、IGKJ1过表达、PSMG3-AS1过表达转染的ND-MSCs6、ND-MSCs7、ND-MSCs8或NDMSCs9中矿化瘤的Von Kossa 染色 and alizarin red 染色。d. 用RUNX2-AS1 siRNA或对照siRNA转染的U266中RUNX2-AS1的qPCR分析。e. 特定外泌体孵育后的MSC中RUNX2-AS1的qPCR分析。GAPDH作内参。f. 特定外泌体孵育48小时后ND-MSCs10中矿化瘤的Von Kossa染色和茜素红染色。g. 用荧光标记的外泌体孵育一定时间后的MM-MSC和ND-MSC的流式细胞分析。（值是平均值±SD，* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001。）

4. RUNX2-AS1负调控RUNX2表达。

图5 lncRNA RUNX2-AS1的特征，RUNX2-AS1在MSCs中细胞核和细胞质位置

a. MSC中的RUNX2-AS1的RNA FISH测定。比例尺，20微米。b. qPCR检测RUNX2-AS1在细胞质和细胞核中的分布。GAPDH作内参。c. 5'-RACE和3'-RACE巢式PCR产物的凝胶电泳。d. 使用有编码能力的计算器（http://cpc.cbi.pku.edu.cn/）预测由RUNX2-AS1编码的蛋白质。FrameFinder的ORF覆盖率：预测的ORF覆盖率是良好ORF质量的指标。LOG-ODDS SCORE是预测的ORF质量的指标，分数越高，质量越好。ORF类型是预测的ORF的完整性，其指示ORF是否以起始密码子开始并以框内终止密码子结束。e. 用于MSC中的RUNX2-AS1体外转录的链特异性RNA探针的Northern blot分析。1：MM-MSCs2，2：ND-MSCs12。β-肌动蛋白用作对照。

5. RUNX2-AS1与RUNX2形成RNA双链体并阻断其剪接。

图6 通过外泌体转移RUNX2-AS1使MSC成骨分化降低的机制示意图

lncRNA RUNX2-AS1可以包装到外泌体中并从骨髓瘤细胞中分泌，转移到MSC。在MM-MSC中，RUNX2-AS1通过干扰其剪接来降低RUNX2的表达，导致MM-MSC的成骨分化减少。该示意图还显示了RUNX2-AS1与RUNX2前体mRNA及RNA：RNA的相互作用区域。框代表外显子。RUNX2外显子是灰色的；RUNX2-AS1外显子是绿色的。内含子表示为线。RUNX2前体mRNA和RUNX2-AS1相互作用以红色虚线表示。长灰色箭头和绿色箭头分别表示有义RNA（RUNX2前mRNA）和反义RNA（RUNX2-AS1）的方向。PrPr：近端启动子，TSS：转录起始位点。

6. 外泌体介导的体内成骨分化减少的作用。

图7 体内外泌体介导的成骨分化减少的影响

a. 在用U266-luc +细胞静脉注射并用GW4869或空白对照处理后原位异种移植的NPG小鼠的典型全身生物发光图像。b. 通过无创生物发光成像监测肿瘤发展。数据表示为平均值±SD（n = 6 /组）。c. 来自空白处理组和GW4869处理组的股骨的微电脑断层扫描分析。在远端股骨的干涉图的典型微CT图像显示空白处理的小鼠中的小梁结构丧失，但是在GW4869处理的小鼠中没有。图中显示了骨小梁的体积（d），连通性（e）和骨小梁分离（f）的骨参数。与空白处理的小鼠相比，GW4869显著改变了血清中的骨转换标志物，增加了P1NP（g）（骨形成标志物）的水平，同时降低了CTX（h）（骨吸收标志物）的水平。（值是平均值±SD，* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，相对于载体对照）。i GW4869处理小鼠或对照小鼠的MSC衍生的RUNX2-AS1和RUNX2的qPCR检测。

结论

研究结果表明外源性lncRUNX2-AS1通过独特的外泌体lncRUNX2-AS1 / RUNX2途径在成骨分化中从MM细胞向MSC转移中发挥关键作用。外泌体lncRNA RUNX2-AS1可能成为MM骨病变的潜在治疗靶点。