在三阴性乳腺癌中LINC01638 lncRNA通过抑制SPOP调节的c-Myc降解而激活MTDH-Twist1信号通路

乳腺癌是多样化疾病，并且三阴性乳腺癌（TNBC）仍然是一个很严重的健康问题。已有研究报道，LINC01638（基因间长非编码蛋白RNA 1638）在人类正常组织中低表达，并且还参与了肝癌细胞的EMT过程。关于lncRNAs在TNBC进展中潜在作用仍然没有探究。鉴于以往研究成果，Guopei Zheng和Xiaoming Xie带领的团队进一步探究了LINC01638在TNBC中的功能，并于2018年6月8日在Oncogene杂志（IF=7.5）上发表了这篇文章。这篇文章证明了LINC01638在TNBC组织和细胞中显著上调，并且能够维持TNBC细胞中的间质特性，包括含有丰富的上皮间质间转换（EMT）信号和癌症干细胞状态。下调LINC01638能够在体外和体内抑制细胞增殖和转移。过表达LINC01638预示着对乳腺癌病人有不良的预后效果。LINC01638能与c-Myc相互作用，能够抑制SPOP调节的c-Mcy的泛素化和降解。C-Mcy能够提高MTDH的表达，进一步激活Twist1的表达，最终诱导EMT。该文章的结果证明，LINC01638能够调节转导信号，并且突出了LINC01638在TBNC发张过程中所扮演的重要角色。

技术路线

结果

图1. 在TNBC亚型中，LINC01638 lncRNA上调

A. qRT-PCR检测 LINC01638在不同乳腺癌亚型组织中的表达情况。B. qRT-PCR检测LINC01638在BC细胞系中的表达情况。CD. 在线分析LINC01638转录本中蛋白编码和核糖体结合位点。EF. 全长LINC01638或ORF克隆到真核表达载体（pCMV-Flag）中，在这两种不同的表达模式下，加或不加N-末端密码子ATG，MDA-MB -231细胞被转染后进行WB检测，p21作为阳参。Flag-抗体用于转录后蛋白的标记，黑色箭头指p21-Flag蛋白。G. 利用qRT-PCR对MDA-MB -231细胞进行分馏，BCAR4作为核基因的阳参，GAPDH作为胞质基因的阳参。

图2.LINC01638能够促进BC细胞的间质性特点

A. 通过转染LINC01638 shRNA，建立LINC01638下调的稳定MDA-MB-231和BT549细胞系。B. 下调LINC01638抑制MDA-MB-231和BT549细胞的增殖。C. 通过转染EXP-LV203-LINC01638载体建立稳定表达LINC01638的T47D细胞系（左），过表达LINC01638促进T47D细胞的增殖。D. 克隆的细胞进行transwell。E. LINC01638下调或过表达后进行克隆后，FACS检测CD44+CD24-(CSC)亚群的表达。F. LINC01638下调或过表达进行克隆后，进行微球体形成实验。G. qRT-PCR检测检测细胞克隆条件下EMT的表达水平。H. WB检测EMT的marker。

图3.LINC01638能够通过MTDH调节间质特点

A. qRT-PCR检测在不同的乳腺癌亚型组织中MTDH的表达情况（左），在组织中LINC01638和MTDH的表达相关性（右）。B. qRT-PCR和WB检测MTDH在细胞系的的表达情况。C. 下调LINC01638后，MTDH表达下调（上）；过表达LINC01638后，MTDH上调（下）。D. 在MDA-MB-231细胞中，过表达MTDH能够抵消下调LINC01638后导致的增殖、侵袭和产生CD44+/CD24− (CSC)亚群的效应。E. 在T47D细胞中，下调MTDH的表达能够抵消过表达LINC01638后导致的增殖、侵袭和产生CD44+/CD24− (CSC)亚群的效应。F. 在MDA-MB-231细胞中，过表达MTDH能够抵消下调LINC01638后导致的EMT的效应。G. 在T47D细胞中，下调MTDH的表达能够抵消过表达LINC01638后导致的EMT的效应。

图4. MTDH在BC细胞中能够被c-Mcy调节

A. 预测c-Myc在MTDH启动子中的结合位点。BC. qRT-PCR（B）和WB（C）分别检测再细胞系中c-Myc下调或过表达后MTDH的表达情况。D. 通过ChIP-qPCR检测，c-Myc主要结合在MTDH启动子的B位点。E. ChIP-qPCR检测显示，影响c-Myc的表达水平后能够影响c-Myc与MTDH启动子的结合水平。F. 在BC细胞系中，通过荧光酶报告系统检测MTDH启动子活性与c-Myc的相关性。

图5.LINC01638与c-Mcy相互作用抑制SPOP调节的降解

A.通过在线软件分析TCGA数据，比较c-Myc在乳腺癌和正常乳腺中的表达情况。B. WB检测，下调LINC01638后MG-132对c-Myc表达水平的调节效果。C. WB检测，下调LINC01638后下调SPOP对c-Myc表达水平的调节效果。D. RIP验证LINC01638和c-Myc、SPOP的相互作用。E. CoIP验证c-Myc和SPOP的相互作用。F. Mapping分析c-Myc与LINC01638相互作用域。全长LINC01638 和缩短LINC01638片段的原理图（左）；在293T细胞中，RIP验证缩短LINC01638片段与c-Myc的相互作用（右）。G. 识别c-Myc蛋白与LINC01638相互结合的区域。c-Myc蛋白的片段（左），在293T细胞中，RIP验证LINC01638与c-Myc的相互作用区域（右）。H. LINC01638对c-Myc核定为的影响。 I. 在MDA-MB-231细胞中，过表达c-Myc能够抵消下调LINC01638后对增殖和侵袭的效应。在T47D细胞中，下调c-Myc能够抵消过表达LINC01638后对增殖和侵袭的效应。

图6.LINC01638能够在体内促进乳腺癌的肿瘤进展

A. 下调LINC01638能够抑制MDA-MB-231细胞来源的肿瘤的生长，上调c-Myc的表达会抵消LINC01638的下调效应。B. 通过尾静脉注射下调LINC01638的MDA-MB-231细胞，下调或过表达c-Myc后，HE染色小鼠肺转移结点。C.在乳腺癌组织中，ISH染色LINC01638蛋白，IHC染色c-Myc、MTDH、Twist1蛋白。D. Kaplan–Meier分析高表达LINC01638后与乳腺癌病人预后的相关性。