附睾精子过渡期间获得的small RNA对小鼠胚胎发育至关重要

哺乳动物精子装载的 small RNA在发育过程中发生显著改变，因为在附睾的睾丸后成熟过程中，几波microRNA和tRNA片段被运送到精子。近日，来自美国马萨诸塞大学医学院的研究人员Rando在DEVELOPMENTAL CELL（IF=9.616）发表了一篇题为“Small RNAs Gained during Epididymal Transit of Sperm Are Essentialfor Embryonic Development in Mice”的文章，他们利用这一发育过程来探测精子RNA有效载荷在胚胎植入前发育中的功能。他们使用从近端（头部）与远端（尾部）附睾获得的精子通过卵胞浆内单精子注射（ICSI）产生受精卵，然后记录所得胚胎发育的表型特征。使用头部精子产生的胚胎在整个植入前发育过程中显着过度表达多种调节因子，随后植入效率低下，并且在植入后很快失败。值得注意的是，将纯化的附睾尾部特异性小RNA显微注射到头部衍生的胚胎中不仅完全挽救了植入前的分子缺陷，而且还抑制了植入后的胚胎致死性表型。这些发现揭示了哺乳动物精子睾丸后成熟过程中小RNA重塑的重要作用，并确定了对精子传递的microRNAs有反应的特定植入前基因表达程序。

技术路线：

主要结果：

1 多个表观遗传调控因子在附睾头部来源精子产生的胚胎中（4细胞，8细胞）的过度表达。

图1 实验路线

（A）从近端（头部）和远端（尾部）附睾获得的精子携带不同的小RNA群（Nixon et al，2015; Sharma et al ，2016）。（B）不同精子来源（ICSI）的胚培养到指定阶段并进行RNA-seq. （C）2细胞阶段合子基因组激活（ZGA）的主要波。平均mRNA丰度的散点图（对于18小时胚胎（前ZGA，x轴）与28小时胚胎（后ZGA，y轴）平均值相比，差异表达的基因（ p <0.05）显示为红色和绿色圆点。（D）2细胞阶段合子（附睾头部和尾部精子来源）18、28小时胚胎显着ZGA基因的热图。（E、F）Caput与Cauda胚胎在18小时（E）和28小时（F）的平均mRNA丰度（如C）的散点图，显示无显著差异。

图2 睾丸后精子成熟对植入前基因调控的影响

（A）附睾头部和尾部的精子产生的胚全部基因表达对比散点图，红色点为37个显著差异基因（P<0.05）（B）在头部胚胎中过表达的8个基因与尾部胚胎在单个4细胞胚胎的数据。黑条显示每组的中值表达胚胎。 *，**和***分别显示调整后的p值低于0.1,0.01和0.001。（C）4细胞胚后期的基因表达差异。（D）在所有阶段95个基因差异表达(p adj <0.1)热图。

2 Caput-Derived胚胎在植入后发育中表现出多重缺陷。

图3附睾头部的精子在移植后早起发育失败

（A）   胚胎移植的实验示意图。（B）睾丸精子和尾部附睾精子都能够支持从受精到出生的类似胚胎发育，而头颅精子独特地引起调节和发育畸变。Caput和Cauda胚胎的成功率.（C）各自用Cauda或Caput胚胎转移,从一只雌性中解剖的所有胚胎的图像。（D）所有胚胎移植解剖的定量分析。

3 睾丸精子和Cauda附睾精子都能够支持从受精到出生的类似胚胎发育，而Caput附睾精子独特地引起调节和发育畸变。

图4 睾丸来源精子产生的胚的分子机制分析

（A）   睾丸来源精子ICSI 过程概要。（B）睾丸精子来源和Canda 附睾来源的胚4细胞时期基因表达的比较。（C-D）比较了4个细胞（C）和胚泡（D）阶段的Cauda和睾丸胚胎之间的mRNA丰度（所有基因的中值tpm> 10）散点图。

4在附睾过渡期间获得的small RNAs挽救Caput-Derived胚的缺陷。

图5 Cauda特异性的miRNA恢复Cauda胚的生长。

（A）Cauda特异性的miRNA纯化和微注射概要图。（B）Cauda特异表达抑制的 RNA 过表达在Caput-derived胚。（C）Caput对mRNA丰度的影响（x轴，log 2倍变化Caput / Cauda）对小RNA注射的影响（y轴，log 2倍变化）的散点图。

5 Cauda特异性small RNAs拯救了Caput-Derived胚胎的发育。

图6  Cauda特异性MicroRNAs，而不是tRFs，可以挽救Caput植入前的缺陷

（A）   MicroRNAs, tRFs 微注射实验概况。（B）附睾体RNA的纯化。 从Cauda附睾体中纯化的两个重复总RNA样品的丙烯酰胺电泳。 框显示了用于微小RNA和tRF的凝胶纯化的边界。（C）单个4细胞期Cauda（n = 23），Caput（n = 23），Caput + microRNA（n = 22）和Caput + tRF（n = 21）胚胎的mRNA丰度，代表性Caput –上调基因。（D）比较Caput效应（x轴）和microRNA效应（y轴）对4细胞期胚胎中mRNA丰度的散点图（E-F）在4细胞期胚胎（E）和胚泡阶段（F）microRNA和tRF对Caput上调基因影响的直方图。

图7 Cauda特异性小RNAs拯救Caput胚胎的发展
（A）Small RNA注射流程图。（B）图像显示了由用RNA显微注射的头部衍生胚胎产生的成功的实例。下表列出了成功率，如图3B所示。