CircRNA通过ceRNA机制调控自噬影响脑缺血性中风

自从大隅良典因细胞自噬获得2016年度诺贝尔生理学与医学奖，自噬的研究热度持续升温。

自噬目前根据发生过程分为三类：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA)。大自噬（Macroautophagy）即我们说的自噬（autophagy）;微自噬（Microautophagy）：是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式; 分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侣，如hsp70，能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。通常说的自噬泛指Macroautophagy.

CircRNA的研究也是近几年开始热门起来的，下面让我们通过一篇文章来介绍如何将这两大热门联系起来。

该文为东南大学的姚红红教授团队于今年6月份发表在Attophagy杂志(IF=11.1)上，题为”Novel insight into circular RNA HECTD1 in astrocyte activation via autophagy by targeting MIR142-TIPARP: Implications for cerebral ischemic stroke“, 揭示circHECTD1同过ceRNA机制调控自噬，参与脑缺血中风过程。

研究人员首先通过circRNA芯片技术在中风小鼠模型-短暂性大脑中动脉闭塞缺血性脑组织中发现环状RNA circHECTD1显著高表达，同时在AIS中风病人的血浆样本得到证实。敲低circHectd1表达后，可明显减少中风小鼠模型的脑梗塞区域,减少神经毒性以及改善星形胶质细胞，进一步分子机制研究表明，circHECTD1可以通过miRNA海绵作用竞争性吸附miRNA-142,抑制miRNA-142的活性，导致TIPARP（TCDD诱导型聚[ADP-核糖]聚合酶）表达的抑制，随后通过巨自噬/自噬抑制星形胶质细胞活化。

研究方案：

1、筛选脑缺血相关circRNA----( circHECTD1在缺血脑组织中上调)

作者首先在中风模型和对照小鼠的缺血性脑组织（n=3）,进行circRNA芯片检测，筛选到5个上调的circRNA(Figure1 A,B,C)； 并设计divergent 和convergent引物在cDNA和gDNA上进行PCR鉴定（Figure1 D），定量PCR结果验证了circ_008488（circHECTD1）的显著高表达；为验证该circ参与中风，作者在急性缺血性中风（AIS）（n=37）和健康人(n=47)血浆中通过PCR验证circHECTD1的上调（E）。

二、 circHECTD1 功能验证-----（干扰circHECTD1后脑梗塞降低）

为验证其中风功能，作者将携带circHECTD1 siRNA的慢病毒显微注射入小鼠侧脑室(A)，验证siRNA的传染效果（B）和干扰circHECTD1的效果（C）,慢病毒注射2周后开始构建tMCAO模型，24小时后核磁共振检查脑梗面积，TTC染色检测体积，发现干扰circHECTD1后脑梗死面积显著降低（D，E）; 神经缺陷得分也显著下降（F）。

三、circHECTD1 作用机制
1.体内干扰circHECTD1后抑制星形胶质细胞活性

为研究其机制，研究者在同样的实验组（中风模型和对照小鼠的缺血性脑组织，n=3）,进行mRNA芯片检检测，发现515个上调和87个下调(1.5倍)mRNA（A，B，C）； 为验证芯片结果，对GFAP进行PCR和wb检测，验证其高表达（D,E）; 并验证GFAP与circHECTD1共定位（F）；为验证circHECTD1角色，将circHectd1-siRNA-GFP注射模型小鼠，免疫荧光显示GFAP与circHectd1-siRNA共定位（G）；脑切片免疫荧光标记星形胶质细胞标志物，显示活性星形胶质细胞出现在皮质半影区（H）; 活性星形胶质细胞在circCon siRNA组中升高，但在circHectd1-siRNA组中得到改善（I,J）, WB进一步验证GFAP在circHectd1-siRNA组中显著降低。

2.体外干扰circHECTD1后抑制星形胶质细胞活性

作者进一步在小鼠星形胶质细胞（AS）和人胶质瘤细胞A172中检测circHECTD1对星形胶质细胞活性的影响。

3. circHECTD1介导的星形胶质细胞活性的机制研究---- circHECTD1 结合MIR142

首先FISH对circHECTD1进行定位，发现主要位于细胞质，因此作者研究其是否作为ceRNA结合miRNA，RNAhybrid软件显示其具有MIR142结合位点（A），FISH显示两者共定位（B），PCR显示MIR142在AIS病人中下调 C, OGD-R处理细胞后MIR142 下调（E,F）；pull down显示MIR142模拟五可拉下circHECTD1 (G)，circHECTD1探针可拉下MIR142 (H).

4. circHECTD1-MIR142的靶基因验证

作者进一步研究MIR142的靶基因。通过预测发现MIR142可靶向TIPARP（A），荧光素酶报告基因实验验证其相互作用（B）； mRNA芯片（C,D） 和PCR、wb（E,F）显示靶基因在模型小鼠中上调。免疫荧光显示TIPARP与GFAP共定位（G）；AS和A172细胞中MIR142可下调TIPARP表达（H,I），体内干扰circHECTD1后TIPARP表达下调（J）.

5. 进一步验证circHECTD1-MIR142-TIPARP促进星形胶质细胞活性

作者通过拯救实验验证这一ceRNA轴中的分子对星形胶质细胞标记物GEAP的表达的调控

6. circHECTD1对自噬的调控

越来越多的证据表明自噬参与了星形胶质细胞的激活，并参与了脑卒中的发病机制，因此作者研究circHECTD1是否通过自噬激活星形胶质细胞。首先证明星形胶质细胞激活与自噬相关：检测OGD-R刺激上调自噬相关蛋白的表达（A,B）和自噬流信号（C）。然后证明circHECTD1影响自噬：免疫荧光显示circHECTD1干扰后抑制OGD-R诱导MAP1LC3B的表达（D）,pcr和wb进一步验证（E,F），体内证明circHECTD1干扰后MAP1LC3B表达降低（G）.

7. circHECTD1-MIR142 axis通过TIPARP调控自噬进而激活星形胶质细胞

circHECTD1-MIR142-TIPARP对自噬的影响：干扰circHECTD1能够改善anti-MIR142诱导的自噬（A），过表达circHECTD1能够改善MIR142诱导的MAP1LC3B-II下调（B）, Tiparp siRNA显著抑制OGD-R引起的自噬（C）。进一步检测自噬对星星价值细胞的影响：自噬抑制剂3-MA降低OGD-R引起的胶质细胞标志物GFAP和自噬标志物MAP1LC3B-II的表达（D，E），自噬激动剂rapamycin起想反作用（F,G）