Cicr-DNMT1能够通过激活自噬促进乳腺癌的进展　

CircRNAs是一类广泛表达在哺乳动物细胞中的非编码RNA。全基因组分析揭示了环状RNA的跨物种分布，并且其特性是进化性保守的，这便进一步揭示了环状 RNA的特定的生理角色与功能。鉴于此，加拿大多伦多大学杨柏华教授带领他的团队探究了circ-Dnmt1对乳腺癌的作用，并于2018年7月4日在Oncogene杂志（IF=7.5）发表了他们的研究成果，环形RNA circ-Dnmt1 通过调控p53和AUF1入核，促进细胞自噬作用。Circ-Dnmt1是DNMT1基因第6和7外显子反向拼接形成的，作者是通过芯片分析发现乳腺癌细胞中普遍存在circ-Dnmt1高表达的现象，因此针对该分子的作用机制展开了研究。过表达circ-Dnmt1能促进细胞增殖，并且能增加对应的Dnmt1的成熟的mRNA水平，但对该基因的转录出产物pre-mRNA没有影响。过表达circ-Dnmt1能促进细胞自噬，免疫荧光实验表明p53和AUF1在circ-Dnmt1过表达后核定位增加了，RIP实验证明了circ-Dnmt1可以与p53和AUF1相互作用。核定位的p53促进自噬相关基因的表达，而核定位的AUF1不能继续调控Dnmt1的mRNA降解作用，导致该mRNA富集并促进DNMT1蛋白的表达。小鼠皮下肿瘤模型实验表明过表达circ-Dnmt1显著增加肿瘤的体积。

技术路线

结果
1. circ-Dnmt1在乳腺癌中高表达　　

图1. 乳腺癌细胞中存在circ-Dnmt1过表达。

（a-c）通过芯片筛选，比较乳腺癌细胞与非癌乳腺细胞中circRNA的表达水平，发现了circ-Dnmt1在所有乳腺癌细胞中均有高表达。d. circ-Dnmt1在基因组的位置及过表达载体的构建构建。e. 验证了相关引物的特异性。f. Northern实验证明了circ-Dnmt1在细胞内的内源表达。g. circ-Dnmt1对MCF-7细胞增殖的影响。

2. circ-Dnmt1促进细胞自噬

图2. MCF-7细胞中过表达circ-Dnmt1可促进细胞增殖。

（ab）. 过表达circ-Dnmt1后细胞衰老的比例明显下降（β-gal染色阳性率低），LC3B明显增多。c. 几种自噬抑制剂处理后circ-Dnmt1表达会增加，这些抑制剂包括：SP600125、Chloroquine、LY294002、Wartmannin。d. 这些抑制剂的处理可阻止过表达circ-Dnmt1导致的细胞增殖和衰老相关的表型。（e-g）过表达circ-Dnmt1后，母基因Dnmt1的mRNA水平增加，但该基因转录初产物pre-mRNA（基于内含子序列的引物）并没有增加，说明不是通过促进该基因的转录水平的作用。（hi）干扰circ-Dnmt1后Dnmt1和LC3B的表达降低，增加了细胞衰老。

3 circ-Dnmt1促进p53和AUF1入核

图3. circ-Dnmt1促进p53和AUF1入核。

a. circ-Dnmt1转染细胞能够提高Dnmt1和LC3B的表达。b. circ-Dnmt1转染细胞后，能够提高circ-Dnmt1在胞核和胞质中的表达水平。c. circ-Dnmt1转染细胞后，降低p53的表达和提高肿瘤形成。d. circ-Dnmt1转染细胞后，能够降低胞质中的p53的表达，提高胞核中p53的表达。不影响Auf1的总体表达，但是降低胞质中的Auf1的表达，提高胞核中Auf1的表达。e. 沉默circ-Dnmt1后能够降低p53和Auf1的核转录。

4 细胞自噬能够提高circ-Dnmt1、p53和AUF1入核

图4. 细胞自噬与circ-Dnmt1表达水平和核定位有关。

（a-h）EBSS 和Rapamycin诱导的细胞自噬条件下，p53和AUF1也会入核，但干扰circ-Dnmt1后，这一入核现象消失。这些自噬诱导剂还可以促进Dnmt1和LC3B蛋白水平的增加。i. 过表达circ-Dnmt1后，circ-Dnmt1的核定位也增加。

5 circ-Dnmt1可与p53和AUF1相互作用　　

图5. circ-Dnmt1可与p53和AUF1相互作用。

基于抗p53和AUF1的抗体RIP实验证明，确实存在circ-Dnmt1于两种蛋白的相互作用。计算机模拟实验也佐证了这一相互作用现象。

6 计算机模拟证明circ-Dnmt1可与p53和AUF1相互作用　

图6 circ-Dnmt1可与p53和AUF1相互作用位点验证。

基于计算机模拟的结果，作者设计了突变载体和反义核苷酸片段，验证是否可阻断circ-Dnmt1与p53和AUF1的相互作用。突变和反义核苷酸均明显抵消了过表达circ-Dnmt1后细胞的影响，包括增殖能力和衰老表型等。p53和AUF1的核定位也受到了影响，说明所预测的位点的确是circ-Dnmt1与p53和AUF1相互作用的位点。

至此，circ-Dnmt1在乳腺癌细胞中的作用机制已成型：高表达的circ-Dnmt1分子通过与p53和AUF1相互作用，最终三种分子均发生入核转移，入核后的p53促进细胞自噬相关的基因表达，入核后的AUF1蛋白不再具有抑制Dnmt1 mRNA的功能，因此促进了Dnmt1蛋白的翻译积累，抑制了p53的转录并促进了肿瘤增殖有关的基因表达。

7 过表达circ-Dnmt1促进肿瘤生长速度

图7体内分析circ-Dnmt1的功能。

皮下肿瘤模型表明过表达circ-Dnmt1后肿瘤的生长速度明显增加。自噬诱导剂也可以有类似的作用，而自噬抑制剂则阻止过表达circ-Dnmt1对肿瘤生长的影响。