miR-103靶向lncWDR59促进内皮适应不良

血流在动脉分叉和弯曲处会受到自然干扰。内皮细胞（ECs）不能适应受干扰的流动，转录直接导致内皮细胞向适应不良表型转变，其特征是受损的内皮细胞慢性再生。microRNA（miRNAs）可以通过靶向编码蛋白RNA调节内皮细胞的适应不良。然而，长链非编码RNAs（LncRNAs），是已知的表观控制因子，也可以是miRNA靶标，但是miRNAs和LncRNAs对内皮细胞适应不良的作用尚不清楚。7月6号德国慕尼黑大学的研究人员在nature communications（IF=12.353）杂志上发表了题为“miR-103 promotes endothelial maladaptation by targeting lncWDR59”的文章，这篇文章表明，高脂血症和oxLDL诱导miR-103上调，miR-103通过靶向新的LncWDR59抑制内皮细胞的增殖并促进内皮DNA损伤。miR1-03通过阻碍LncWDR59与Notch1抑制剂Numb相互作用，从而影响Notch1诱导的内皮细胞增殖。此外，miR-103通过影响Notch1相关的β-连环蛋白共激活，增加增殖的内皮细胞对oxLDL诱导的有丝分裂畸变的敏感性，其特征是增加微核形成和DNA损伤积累。总的来说，这些数据表明miR-103通过靶向LncWDR59使内皮细胞向适应不良表型转变，这可能促进动脉粥样硬化。

技术路线：

结果：

图1 在EC-Dicer flox小鼠中的LncRNAs上调，let-7b和miR-103的靶向LncRNA。

（a）来自EC-Dicer flox小鼠与喂食12周HFD的EC-Dicer WT小鼠的主动脉中差异表达的lncRNA基因的全基因组微阵列分析的饼图。（b）97个显著上调的lncRNA。（c）2个新lncRNA的完整转录物序列。（d）let-7b和miR-103靶向的LncRNA。（e）qPCR验证MAoECs中一些lncRNAs在EC-Dicer flox小鼠体内上调。（f）qPCR验证let-7b和miR-103抑制物存在的情况下lncRNAs的表达。（g）免疫沉淀（GW182-IP）后qPCR测量let-7b或miR-103类似物转染MAoEC后lncRNA转录物富集情况。

图2 筛选miR-103靶标lncRNAs并鉴定miR-103靶向lncWDR59。

miR-103的靶标lncRNAs在不同细胞或条件的qPCR表达：（a） MAoECs和BMDM中的表达，（b）MAoECs在高或低切应力下的表达，（c）MAoECs中oxLDL的处理24个小时，（d）好发部位ARCH和非好发部位Thoracoabd，（e）正常饮食（ND）或高脂饮食（HFD）12周，（f）EC和斑块部位。（g）在12周HFD喂养的EC-Dicer WT和EC-Dicer flox小鼠上进行miR-103和lncWDR59的原位杂交。（h）TSB特异性抑制miR-103与lncWDR59转录物的结合。

图3 miR-103靶向lncWDR59通过Wnt和Notch1信号传导途径调节EC增殖。

用miR-103抑制剂（miR-103inh），lncWDR59 Gapmers（GlncWDR59）或TSB（a）转染MAoEC 24小时以检查Ccl2和Cxcl1相对表达或（b）用抗Ki67抗体染色通过qPCR分析它们的增殖和cdkn1a表达。（c）将MAoEC与EdU和TSB或对照LNA一起孵育。使EC经受LSSHSS并染色。（d）用siCtnnb1或sDAPT处理MAoEC 24小时，用抗Ki67抗体染色以分析它们的增殖。（e,f）miR-103抑制物，TSB或GlncWDR59检测NICD和β-连环蛋白的表达。（g - j）MAOECs用DAPT或siCtnnb1单独或与TSB联合处理24小时进行分析（g）通过Ki67染色的EC增殖。（h）用DAPT或DMSO刺激Ki67 + TSB + siCtnnb转染的MAoEC的分析。分析β-连环蛋白（i）或NICD（j）核定位。

图4 LncWDR59与Notch1抑制剂Numb的相互作用。

（a）用miR-103或对照-LNA抑制剂处理24小时的MAoEC中的核和细胞质lncWDR59水平。b通过qPCR分析在NICD免疫沉淀（IP）之后的MAoEC中的LncWDR59表达。（c）表示lncWDR59和Numb之间相互作用倾向分析的热图。（d）miR-103抑制物处理MAoECs24个小时通过qPCR分析LncWDR59表达。（e）NICD与Numb定量的结合来评估Numb-IP效率。

图5 lncWDR59在ECs中对高脂血症介导的DNA损伤和MN形成的作用。

（a）用25或100μgml -1 的oxLDL 处理24小时后MAoEC中Ki67或磷酸化γH2AX组蛋白的免疫荧光分析。（b）ND或HFD并染色γH2AX和CD31。（c）与EC-Dicer WT小鼠相比，EC-Dicer flox小鼠γH2AX + vWF +的分析。（d）用TSB处理24小时的MAoEC用或不用25μgml -1 oxLDL后γH2AX +分析。（e） MAoECs被用于与DAPT或siCtnnb1分析24个小时处理的核γH2AX +染色。（f）用ND或HFD喂养12周的Apoe - / -小鼠γH2AX 和MN分析。（g）25或100μgml -1 oxLDL 处理24小时 后MN形成和γH2AX +的分析。（h）用TSB处理24小时并用或不用25μgml -1 oxLDL 刺激MN形成和γH2AX +分析 。（i）DAPT或siCtnnb1与25μgml -1 oxLDL组合处理24小时后MN形成和γH2AX +分析。

图6 Sox17在β-连环蛋白激活，MN形成和DNA损伤中的作用。

（a）用TSB处理后MAoEC中的Sox17表达的 qPCR分析。（b）用DAPT或siCtnnb1处理24小时后MAoEC中Sox17表达的qPCR分析。（c,d）分析核（星）和核周（箭头）β-连环蛋白，活化的Notch细胞内结构域（NICD）（c）核Ki67染色（d）用Sox17单独或与TSB组合处理24小时的MAoEC。（e,f） γH2AX+和MN的分析。

图7 MiR-103 / lncWDR59在动脉粥样硬化期间在体内具有保守功能。

（a）EVG染色，（b）Ki67和（c）γH2AX免疫荧光染色。

图8 人类lncWDR59的保守作用。

（a）人类lncWDR59（hsa-lncWDR59）序列的基因座和完整转录物。（b），用miR-103类似物富集lncWDR59。（c）用hsa-lncWDR59 gapmer（hGlncWDR59）转染HAoEC48小时后Ki67免疫染色和MN形成的分析。（d） miR-103和lncWDR59在人斑块上的原位杂交。缺乏病变的区域用作对照区域。（e）hsa-lncWDR59与SOX17表达和Ki67染色的相关性。