高分文章揭示miRNA最新调控机制

随着非编码RNA研究成果的不断涌现，要发高分文章就需要寻找新的模型、研究最新的机制。目前 lncRNA染色质调控和ceRNA机制的研究比较成熟，然而其作为miRNA cluster前体在肿瘤及耐药上的作用研究还比较少。近日（10月16），范德堡大学的研究者在Nature Medicine（IF=29.8）上以“lncRNA MIR100HG-derived miR-100 and miR-125b mediate cetuximab resistance via Wnt/β-catenin signaling”为题，报道了lncRNA作为miRNA cluster前体，诱导癌症耐西妥昔单抗（cetuximab）的新机制。

亮点：

1、首次发现lncRNA MIR100HG 及其衍生的miR-100, miR-125b在药物耐药中的作用。

2、miR-100 和miR-125b cluster的协同耐药作用。

3、GATA6和MIR100HG/ miR-125b的负调控回路。

研究思路：

1、3D细胞培养构建耐药细胞模型：作者使用3D细胞培养系统将cetuximab敏感的结直肠癌细胞连续4个月暴露在cetuximab中，获得耐药细胞。

2、筛查耐药相关基因：作者对耐药和非耐药CRC细胞进行全外显子测序、全转录组测序和small RNA 测序，最后发现lnc MIR100HG、mir - 100和mir - 125b在耐药细胞中上调。作者发现lnc MIR100HG是mir - 100和mir - 125b的宿主机因， 随后利用qPCR、 FISH、TCGA数据库和不同耐药程度细胞检测表达，验证这几基因在耐药中上调。

3、miR-100 和 miR-125b 协同耐药功能研究： 通过慢病毒过表达miR-100、miR-125b及它们双顺反子，通过对应的spongs 消减；然后检测克隆数、利用免疫荧光检测生长和凋亡marker、动物实验验证肿瘤大小和重量。结果发现双顺反子促耐药细胞生存能力最强，证明两个miRNA的协同耐药作用。

4、miR-100 和miR-125b 耐药机制研究：预测miRNA的靶基因，通过荧光素酶报告基因实验等证明wnt的几个抑制剂可作为miR-100 或miR-125b的靶基因，同时通过免疫荧光、qPCR和动物实验验证miR-100 或miR-125b通过wnt 通路调控耐药。

5、调控miR-100 和miR-125b的机制：为研究miR-100 和miR-125b上调的原因，首先寻找宿主基因lnc MIR100HG启动子上的转录因子。通过wb、免疫荧光和免疫组化证明转录因子GATA6在耐药细胞中下调；通过荧光素酶报告基因实验、敲除等实验证明GATA6抑制lnc MIR100HG启动活性。同时，作者发现 GATA6 具miR-125b结合位点，通过荧光素酶报告基因实验及过表达/敲除实验证明它们的负调控。从而证明GATA6和MIR100HG/ miR-125b的负调控回路。

6、临床样本验证cetuximab治疗结直肠癌耐药后MIR100HG、miR-100和miR-125b上调。