MiRNA 如何卖高分?--巧联肿瘤免疫!
栏目:最新研究动态 发布时间:2018-10-18
2018年度诺贝尔生理或医学奖颁给了美国科学家詹姆斯·艾利森(James P。 Allison)和日本科学家本庶佑......

2018年度诺贝尔生理或医学奖颁给了美国科学家詹姆斯·艾利森(James P。 Allison)和日本科学家本庶佑(Tasuku Honjo)。两位科学家因发现“抑制负免疫调节的癌症疗法”获此殊荣。

作为全球抗肿瘤药物市场最闪耀的明星,以PD-1、CAR-T为代表的免疫疗法近几年风靡全球,国内研发热情空前。此次诺贝尔生理学或医学奖颁给了免疫疗法先驱,相关研究也有望在明年基金申请上变得更加受宠。

如何将肿瘤免疫治疗与当下其他热门的研究关联起来?


首先看下今年中标基金PD-1研究情况:

1. PD-1/PDL-1与非编码RNA:

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2. PD-1/PDL-1与自噬:

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接下来介绍一篇miRNA调控肿瘤免疫微环境的文章:

“microRNA 125a Regulates MHC-I Expression on Esophageal Adenocarcinoma Cells, Associated With Suppression of Antitumor Immune Response and Poor Outcomes of Patients”18年9月份发表在Gastroenterology(IF:20)上。

该研究发现,在食管癌细胞系和肿瘤组织中, MIR125a-5p和MIR148a-3p水平增加可降低抗原呈递所需的TAP2和MHC-I的水平。食管癌高表达的MHC-I分子与适应性免疫应答的标记物相关,且显著缩短患者的总体生存时间。

该文章机制简单:miRNA-靶向MHC-I通路上的TAP2。

样本:两株细胞系,51个食管癌病人包埋癌组织,及病人信息。

研究手段只涉及一些常规实验:RNA-seq,  qPCR,  wb, 荧光素酶报告基因实验,流式,细胞毒性实验。生信分析:基因集富集分析;统计学:Cox回归分析通路与OS和RFS的关系, KM生存分析。

 

主要研究方案:

1. 寻找差异表达MHC-I 通路的食管癌细胞系

为确定食管癌中MHC-I基因表达的潜在调控机制,首先使用两个食管癌细胞系:OE33和OE19。之前PCR证明 OE33和OE19细胞在参与抗原呈递机制的TAP1和TAP2表达上存在差异。

这里作者进一步验证TAP1、TAP2和HLA-B 的RNA和蛋白质水平在OE19中较OE33中低表达(图1 A-C)。

MHC通路激动剂IFNG处理OE19细胞后,这几个基因表达增加((图1D)。使用细胞芯片证实该通路在OE19细胞中下调(图1E)。

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2. 筛选OE33和OE19细胞中差异miRNA

qPCR芯片检测88个调控免疫的miRNA在这两株细胞中的表达(图2A)

对OE19细胞中上调的7个miRNA进行单个PCR,都获得验证(图2B)。

而结合位点预测只发现MIR125a-5p和MIR148a-3p靶向MHC-I通路中的基因(图2C),其中MIR148a-3p已被报道。

荧光素酶报告基因实验进一步验证MIR125a-5p靶向TAP2(图2D、E)

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3. 验证MIR125a-5p和MIR148a-3p对靶基因的调控,导致免疫逃逸

MIR125a-5p mimics 转染OE33细胞,qPCR和WB验证 靶基因TAP2表达下调(图3A、B)

流式细胞术显示,转染MIR125a-5p或MIR148a-3p后,MHC-I细胞表面表达下降(图3C)

验证MHC通路激动剂IFNG对这两个miRNA的调控:IFNG处理后,MHC-I缺陷的OE19细胞中两种miRNA水平显著降低(图3D)。解释了图1中,IFNG处理后TAP2等上调情况。

接下来,作者研究由MIR125a-5p和MIR148a-3p诱导的TAP2和MHC-I表达降低是否对特异性CTL识别和杀伤肿瘤细胞有功能影响。MIR125a-5预转染降低T细胞诱导的细胞毒性(图3E)

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食管癌组织MIR125a-5p原位杂交和TAP2免疫组化验证表达及两者相关性(图4)

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4. MHC-I通路表达与抗肿瘤免疫应答及肿瘤复发的关系

作者使用一个整合基因表达(51个病人RNA-seq)、生存数据和通路的疾病分型管道(图5A)。

发现能够反映MHC-I介导的抗原呈递 的通路位于前3个的免疫相关通路,且能将患者分为两组,生存率显著差异(图5B)。

KM生存率分析显示,抗原呈递途径的高表达与新辅助放化疗后手术切除患者的不良RFS和OS相关(图5C、D)。

将低表达和高表达上述基因的患者进行KM生存率分析,结果显示,TAP1高表达与不良OS相关,而TAP1、TAP2和HLA-A与不良RFS相关(图5E、F);

利用基因集富集分析“抗原呈递”途径的表达,定义MHC-I“低”和“高”患者亚群 (5G),MHC-Ihigh亚群,与临床反应抗PD-1 相关(图5H), 而高表达PD-L1, PD-L2, and IDO1与不良RFS相关(图5I-K),高表达PD-L1与不良OS相关(图L)

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5. 食管癌中肿瘤免疫微环境的IHC鉴定

最近的研究表明,结合基因表达谱和免疫组化在预处理活检中提高了预测免疫治疗反应的准确性。为在蛋白水平上分析所用食管癌样本的肿瘤免疫微环境,作者对石蜡包埋组织进行了CD8A、PD-1、PD-L1和PD-L2的IHC分析。与RNA-seq分析结果一致,与未复发的患者相比,复发且MHC-I表达较高的患者肿瘤中CD8A、PD-1、PD-L1、PD-L2阳性细胞增多。

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