体内定时炸弹的引线——lncRNA H19与腹主动脉瘤

   腹主动脉瘤（AAA）是一种腹部主动脉异常扩大的病变，其发病隐秘，致死率高，破裂后如不经救治，24小时生存率小于50%，而总死亡率则高达85%～95%，宛如深藏体内的“定时炸弹”。这枚埋在体内的“定时炸弹”的危险性使得它逐渐得到重视，许多学者将如何治疗它当做一个值得攻克的难题，寻找诱发其发展因素。                                                                        

今年4月，Dr. Yili Sun等人在杂志《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》上发表了一篇名为“LncRNA H19 promotes vascular inflammation and abdominal aortic aneurysm formation by functioning as a competing endogenous RNA”的文章，文章介绍了LncRNA H19 如何促进血管炎症进而诱导腹主动脉瘤形成的，为治疗AAA提供了一个新的研究方向。
背景：腹主动脉瘤（AAA）被认为是一种慢性血管炎症性疾病。然而，在整个腹主动脉瘤形成的过程中，炎症反应是如何被调控的尚不完全清楚。

结果：qRT-PCR检测到H19在人类与小鼠组织样本中的表达上调。H19和巨噬细胞标识物MAC-2的共染色显示H19位于血管平滑肌细胞(VSMCs)和浸润的主动脉巨噬细胞中。H19在体内的过表达增强了血管炎症并诱导AAA形成，其支持因素有主动脉形态恶化，主动脉最大直径值、弹性蛋白降解、白细胞介素-6 (IL-6)和巨噬细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)表达以及巨噬细胞浸润。 H19抑制表现出了相反的效果。解救实验表明，IL-6中和作用能显著缓和因H19过表达诱发的主动脉炎症和AAA的形成。荧光素酶报告分析和体外实验利用VSMCs和巨噬细胞证明，H19与let-7a microRNA内源性竞争诱导其靶基因IL-6的转录，在一定程度上诱导动脉瘤形成。这个机制通过利用不能与let-7a有效结合的突变体H19的体内实验进一步证实。

结论：本研究揭示了AAA形成过程中一条致病性H19/let-7a/IL-6炎症通路，并为AAA的治疗提供了一种潜在的新策略。
研究结果：

Figure 1.H19在人类主动脉瘤样品和Ang II-、CaC12-诱导的小鼠主动脉中再表达

A到C，人主动脉IL-6（A），MCP-1（B）和H19（C）表达水平的qPCR结果（n=5）。连续28天给雄性ApoE-/-小鼠灌注Ang II (1μg/kg/min)或等量生理盐水。D，小鼠主动脉H19表达的qRT-PCR分析（n=5）。E，在主动脉连续样本片段中，H19的原位杂交复合染色和巨噬细胞的免疫荧光染色(MAC-2)（n=5）。雄性C57BL/6J小鼠肾主动脉上用CaCl2纱布或生理盐水纱布处理15分钟。3周后进行检测。F，小鼠主动脉H19水平的qRT-PCR结果（n=5）。G，H19的原位杂交复合染色和巨噬细胞的免疫荧光染色(MAC-2) (n=5)。数据以三次独立实验的平均值±SD表示，**P<0.01.

Figure 2.在Ang II-治疗的 ApoE-/- 小鼠中，H19的减少阻止了AAA的形成
用Scr-RNA或Sh-H19转染雄性ApoE-/-小鼠（每组25只）。三十天后，再连续28天注入Ang II。生理盐水，连续28天给雄性ApoE-/-小鼠灌胃与生理盐水等量的假生理水（每组10例）。A，主动脉宏观特征的代表图像。B，主动脉的二维超声和彩色多普勒成像。C，AAA发生率的统计学分析（每组25例）。D，腹主动脉最大直径（每组16例）。E，主动脉中代表性的弹性蛋白染色和弹性蛋白降解评分。照片显示了弹性蛋白降解最严重的位置(每组n=15；比例尺:上200µm下50µm；放大的照片)。F，主动脉MAC-2免疫荧光染色具有代表性(每组4例；比例尺：上200µm下50µm；放大的照片)。数据表示为平均值±SD或中位数和IQR(弹性蛋白降解评分)。 *P<0.05, **P<0.01

Figure 3.在Ang II治疗的C57BL/6J小鼠中H19过表达诱导AAA形成

雄性C57BL/6J小鼠分别转染AAV-GFP或AAV-GFP- h19(每组25只)。30天后，再连续28天注入Ang II。生理盐水，连续28天给雄性C57BL/6J小鼠灌胃与生理盐水等量的假生理水（每组10例）。A，主动脉宏观特征的代表性图像。B，主动脉二维超声及彩色多普勒成像。 C，小鼠AAA发病率的统计分析（每组N=25）。D，腹主动脉最大直径(每组16个)。E，主动脉弹性蛋白染色及弹性蛋白降解评分具有代表性(每组n=15)。照片显示的位置发生最严重的弹性蛋白降解(比例尺：上200µm下50µm；放大的照片)。F，主动脉MAC-2蛋白表达的代表性免疫荧光染色及统计学分析(n=4;比例尺：上200µm下50µm；放大的照片)。 数据表示为平均值±SD或中位数和IQR(弹性蛋白降解评分)。*P<0.05，**P<0.01。

Figure 4. H19过表达促进CaCl2-治疗的C57BL/6J小鼠体内AAA的形成

雄性C57BL/6J小鼠在用CaCl2纱布处理肾上主动脉前30天，分别注射病毒载体AAV-GFP- h19或AAV-GFP（每组n=25)。生理盐水，用等量生理盐水处理假生理盐水注射的雄性C57BL/6J小鼠（n=10）。CaCl2治疗3周后进行检测。A，AAA的代表性图片。B，腹主动脉的最大动脉直径（每组n=10）。 C，病毒注射后主动脉H19 RNA水平的统计分析（每组n=4）。 D，小鼠主动脉弹性蛋白染色及降解评分具有代表性。照片显示了弹性蛋白降解最严重的地方（每组n=10；比例尺：上 200 µm，下50 µm; 放大的图片）。E，主动脉MAC-2蛋白表达的代表性免疫荧光染色及统计学分析（每组n=4，比例尺：上200 µm，下50 µm；放大的图片）。数据表示为平均值±SD或中位数和IQR(弹性蛋白降解评分)。**P<0.01。

Figure 5. H19在VSMCs中起着let-7a海绵的作用
A，H19与let-7a、IL-6与let-7a之间的潜在结合位点以及构建的突变体结合位点。B，荧光素酶报告基因检测结果。用功能性let-7a mimics或无效let-7a 类似物 (mimicNC)瞬时转染VSMCs。24h后，用含有野生型IL-6 (IL-6- WT)或突变型IL-6 (IL-6- MUT)的荧光素酶报告转染。24h后检测荧光素酶活性。 C，双荧光素酶报告基因检测结果。用功能性let-7a模拟物(let-7a mimics)或无效的let-7a模拟物(mimicNC) 瞬时转染VSMCs，然后用含有野生型(H19- WT)或突变体H19 (H19- MUT1, H19-MUT2)的荧光素酶报告转染。24h后检测荧光素酶活性。D，双荧光素酶报告基因检测结果。 瞬时转染功能质粒介导的H19转录本(pcDNA3.1-H19)或假转录本(pcDNA3.1-NC)，选择性加入功能let-7a模拟物。之后，用含有野生型IL-6 (IL-6- WT)或突变型IL-6 (IL-6- MUT)的荧光素酶报告基因转染细胞。24h后检测荧光素酶活性。**P<0.01。实验四重复。

Figure 6.主动脉H19靶向并负向调节let-7a促进IL-6在VSMCs的表达

Figure 7．较高的let-7a生物活性可延缓Ang II-治疗的C57BL/6J小鼠体内AAA的形成

雄性C57BL/6J小鼠转染AAV-H19或AAV-H19-mut(每组n=26)。30天后，他们又被注入Ang II，持续28天。A，主动脉宏观特征的代表性图像。B，腹主动脉最大直径(每组n=14)。C，AAA发生率统计分析(每组n=26)。D and E，主动脉中代表性弹性蛋白染色(D)和弹性降解分数(E)。照片显示了弹性蛋白降解最严重的地方（每组n=14；比例尺：上200 µm，下50 µm；放大的照片)。 F and G，主动脉MAC-2代表性免疫荧光染色(F)及其统计分析(G)（每组n=4；比例尺：上200 µm，下50 µm；放大的照片）。 H，血浆IL-6浓度(每组n=8)。数据表示为平均值±SD或中位数和IQR(弹性蛋白降解评分)。*P<0.05， **P<0.01。

Figure 8. 证实IL-6在h19促进AAA形成过程中的炎症中介作用

用AAV-H19转染雄性C57BL/6J小鼠。30天后，随机给予托珠单抗(TCZ，一种针对IL-6受体的单克隆抗体)或等量的IgG(每组n=30)治疗。治疗24小时后，所有小鼠再灌注Ang II 28天，然后处死进行检查。A，两组宏观主动脉代表图像。B，腹主动脉最大直径(每组n=14)。C, AAA发生率统计分析(每组n=30)。D和E，主动脉中代表性弹性蛋白染色（D）和弹性降解分数（E）。照片显示了弹性蛋白降解最严重的地方（每组n=14；比例尺：上200 µm，下50 µm；放大的照片）。F和G，主动脉MAC-2代表性免疫荧光染色(F)及其统计分析(G)（每组n= 5；比例尺：上200 µm，下50 µm；放大的照片）。 数据以均数±标准差表示。*P<0.05，**P<0.01。