敲黑板：circRNA在膀胱癌中研究新进展
环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类具有闭合环状结构的非编码RNA，它所具有的高稳定性、物种间的高保守性以及组织特异性等特点,已被研究者视为有望成为临床诊断、治疗及预后等新的分子生物标志物及靶向治疗靶点。circRNA在癌症中的应用也逐渐成为科研热点，但是研究大多数集中在胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等癌症中，circRNA在膀胱癌中的表达模式和机制研究较少。今天，小编来给大家分享一篇最新发表在Molecular Cancer 上面的一篇关于circRNA在膀胱癌中的作用研究的文章。
这里讲述了circRNA作为竞争性内源RNA(Competing endogenous RNA, ceRNA)机制来发挥作用的研究思路，这也是目前报道最多的circRNA经典作用机制。
文章技术路线：
研究成果：
1.筛选出这个circ在膀胱癌中显著下调并进行了相关验证
筛选circRNA：根据以前的测序结果，发现下调基因比较多，挑选出下调基因的前五名，用20对配对的癌组织和癌旁组织进行Q-P验证，发现circSLC8A1下调最显著。一代测序鉴定出，circSLC8A1是SLC8A1基因的外显子1环化形成的。在70对膀胱癌组织和正常膀胱组织中检测circSLC8A1的表达，发现在癌组织中显著下调，并且样本中80%样本组织中circSLC8A1的表达是降低的；另外，与正常的膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1相比较，circSLC8A1在六个肿瘤细胞系中都是低表达。之后，设计引物鉴定SLC8A1 circSLC8A1，用5637、T24细胞的cDNA和基因组DNA(Gdna)做模板进行扩增，发现circSLC8A1仅在以外扩引物扩增cDNA中能检测到，经过Q-P也能确定circSLC8A1对RNA酶耐受
2. circSLC8A1的过表达能抑制肿瘤细胞迁移侵袭（功能实验）
5637和T24细胞过表达circSLC8A1，同时SLC8A1 mRNA表达不受影响，划痕实验、transwell证明circSLC8A1过表达能显著抑制肿瘤细胞迁移侵袭。之后通过小RNA降低circSLC8A1表达，但不影响SLC8A1 mRNA表达，同样实验发现细胞迁移侵袭能力增加
3.验证完circSLC8A1的表达模式和功能开始寻找作用机制:先验证公认的海绵作用
根据circSLC8A1的海绵作用寻找相关的miRNA，通过三种公开的预测工具选出7个候选miRNA，在两种肿瘤细胞一株永生化细胞中通过pull-down实验验证他们与circSLC8A1是否直接相关。结果显示miR-130b和miR-494是在3个肿瘤细胞系中都能被circSLC8A1拉下来的miRNA。用miRNA mimics进一步验证两者的直接联系，结果显示mimics能捕捉更多的circSLC8A1。荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）实验验证了circSLC8A1和两个miRNA都是在细胞质中。以上三个实验结果都证明了circSLC8A1能直接绑定miR-130b和miR-494
4.检测miR-130b和miR-494在膀胱癌中的作用
Q-P结果显示2个miRNA在肿瘤组织上调，相关性分析显示circSLC8A1与MiRNA是负相关。之后检测2个miRNA过表达后对细胞功能的影响：CCK-8检测细胞miRNA过表达显著促进细胞增殖，transwell显示过表达能促进细胞迁移侵袭，若抑制miRNA则抑制细胞迁移侵袭。有研究显示miRNA能通过序列识别进行mRNA的转录后调控，通过软件预测发现这2个miRNA能绑定PTEN的3′-UTR，荧光素酶报告基因实验显示过表达2个miRNA能显著降低PTEN表达，同时进行WB验证。Figure4主要检测两个miRNA的功能，并且筛选出其下游靶基因。以上只是找到了膀胱癌密切相关的circSLC8A1，并且找到与circSLC8A1有直接关系的miRNA及其下游靶基因，也验证了miRNA在膀胱癌中的作用
5. 探究circSLC8A1能否通过调控miRNA进而调控PTEN表达、抑制肿瘤进展
在肿瘤细胞内共转染这circSLC8A1和两个miRNA，cck-8和transwell检测发现circSLC8A1过表达抑制细胞迁移侵袭增殖能力，但当miRNA也过表达后就很大程度上消弱circSLC8A1的抑制迁移侵袭增殖能力。并且，发现相对于只过表达circSLC8A1，共转染circSLC8A1和miRNA能显著降低PTEN的表达。之后在10对乳腺癌组织和正常癌旁癌症检测PTEN的表达， 发现癌组织中PTEN表达降低。以上得出结论circSLC8A1能充当miRNA海绵进而调控PTEN表达
6.体内功能实验
T24细胞稳定转染circSLC8A1，注射到BALB/c裸鼠皮下，之后每周测量长出来的肿瘤体积，发现与对照相比，过表达circSLC8A1的一组肿瘤生长速度慢，肿瘤重量都显著减小，并且发现过表达circSLC8A1的肿瘤组织中circSLC8A1表达显著上调，miR-130b和miR494表达显著下调，免疫组化结果显示PTEN表达升高。再次验证了三者之间有紧密联系
已知PTEN是PI3K/AKT信号通路的负调节因子，而MMP-9蛋白是肿瘤迁移的关键因子，它能被这个信号通路调控，所以免疫组化结果又检测了AKT,P-AKT,MMP-9的表达，发现circSLC8A1过表达能抑制AKT,P-AKT、MMP-9的表达，发现都是表达降低体内实验证明circSLC8A1能调控PTEN表达抑制癌症进展
总结：
1.找到靶点并发现circSLC8A1在膀胱癌中有作用
2.探究circSLC8A1作用机制： circSLC8A1/miRNA-130b，miRNA-494/PTEN轴