新生物信息技术-EISA：解析转录和转录后过程对基因表达变化所起的作用

分裂分析(EISA)是一种生物信息技术，通过对RNA-Seq的分析，将转录和转录后效应分离开来，并将其映射到外显子和内含子。可测量在不同条件下mRNA和前体RNA水平的变化，可以区分转录水平上调控的RNA或在转录后水平——miRNA成熟或正在降解。上皮间充质转化（EMT)是一个备受关注的课题，认识其机制有助于研究肿瘤转移和药物敏感性等问题。虽然EMT受许多miRNAs和转录因子的调节，然而miRNAs和转录因子的功能很难区分，一部分原因是从测序数据集中难以直接识别miRNA靶基因，以及难以确定miRNA效应，本文主要阐述miRNAs参与EMT过程中如何在转录组中发挥作用，而运用了一种生物信息技术-EISA（exon-intron split analysis）。（Nucleic Acids Research，IF=11.147 ，Extensive transcriptional responses are co-ordinated by microRNAs as revealed by Exon-Intron Split Analysis (EISA)）
研究背景：miR-200c是一个促间质转化上皮的 microRNA。
一、EISA成功区分转录和转录后基因调控

      我们初步比较人乳腺上皮细胞(HMLEs)的内含子丰度的变化与活性和非活性基因的标志的一致性。
图A：一种通过TGF进入间充质状态EMT细胞模型(MesHMLE)， miR-200C驱动间质向上皮转化后，前5%的转录上调和下调基因 (ΔI)，由ChIP-Seq获得活性染色质(H3K4me3，H3K9-14ac，H3K27c-绿色)和非活性染色质(H3K27me3-红色)的标记物的相对富集。在一个跨越25个基因滑动窗口中红色/绿色阴影显示了测量的均值。(每第5个窗口绘图)。
图B：由EISA分析所有组蛋白标记与转录水平上的基因表达相关(大ΔI)。相反，活性基因和非活性基因的标记与转录后调控的基因(大ΔE-ΔI，小ΔI，图1B)的相关性小.因此，EISA度量ΔI表明了基因转录的影响。基于图A的ΔE-ΔI的评分。
图C：对转染miR-200C的mesHMLE细胞的RNA-seq数据进行EISA分析，以评价miR-200C相对转录和转录后效应。基于ΔE:ΔI， 转录后miR-200 C靶点的测量值负值。
图D：由ΔE-ΔI、ΔI、ΔE确定基因表达的累积分布（fold change），来预测响应miR-200C的靶位点。
二、miR-200c转录后调节EGF信号网络

      鉴于EISA能有效区分转录和转录后调节，我们关注在转录后下调基因。对miR-200C和预测的靶点进行分析，以及确定在HMLE系统中由miR-200C直接调控的基因和通路。
图A：通过TargetScan或MicroT-CDS预测miR-200c的靶基因，（ΔE-ΔI，前1000位转录后负调控基因）。通过基因本体论研究靶基因之间的关系，发现在EMT中EGFR信号通路的foid enrichment是最高的。 
图B：转录后下调基因的大多数是预测的高重叠和预测目标的靶基因。通过the targetscan and microT-CDS algorithms预测，miR200c和miR200c目标反应的1000、500和200个转录后下调的基因。
图C：在EGF信号网络3’ UTR 荧光素酶报告基因测定miR-200c靶标。
图D：在EGFR下游的信号网络中miR-200C的靶基因(蓝色阴影)。KEGG pathway显示Akt和ERK被激活。
图E：用EGF处理Meshmle细胞，Western Blot检测在miR-200c表达或不表达的情况下的EGFR、Akt、MEK和ERK(或总蛋白)的磷酸化。
三、在EMT/MET过程中Mir-200 c和TGFβ共同调节的转录反应。

图A：ΔE-ΔI (转录后),ΔI (转录)表示EISA定义的基因调控效应. 虽然miRNAs的直接作用是转录后产生的，例如miR-200 c对EGF信号的抑制，图中分别显示miR-200 c与TGFβ在EMT/MET过程中发生的基因表达变化，其发生ΔE-ΔI (转录后)与ΔI (转录)。
图B：虽然已经确定miRNAs和转录因子(TGFβ)之间的相互作用，但miRNA研究的一个主要焦点是通过直接作用于靶标来理解其功能。然而，EISA表明，许多对miR-200C的反应是间接的(ΔI)。为了探讨这些转录变化的意义，基因本体论(分子功能)分析了在MEHMLE细胞对miR-200反应和在HMGLE细胞中对TGF反应的转录水平上调和下调基因集。
图C：在转录上调的基因中，例如ZEB 1等，间质促进转录因子的结合位点富集在ENCODE ChIP- Seq数据集。每个条形表示单个ChIP- Seq数据集。
图D：相对于miR-200c(ΔE-ΔI)转录后下调的相对程度，显示了TFs介导下游转录变化。转录后被miR-200 c下调且在它们的3’端内具有miR-200 c结合位点的TFs。
图E：TF靶基因是从 ChIP- Seq数据中获取的，然然后与根据miR-200转录上调或下调的基因交叉引用。
四、功能显著的转录调控是miRNAs的一个广泛特征。

图A-B：为了研究miRNA干扰中是否与转录反应有关，我们对EISA进行了多个数据集的分析，发现在所检测的8个转录反应中，27%到73%的基因是共同的。表达ZEB 1或多个miRNAs的转录和转录后机制的相对贡献用散点图(B)( ΔE-ΔI：ΔI)
图C：无论这是转录上调基因还是下调基因，为每个选定的miRNA进行10个基因 fold enrichment。