H19-乳腺癌的潜在治疗靶点

对于激素受体阳性的乳腺癌来说，它莫西芬的耐药性仍然是一个临床挑战。近年来，自噬失调被认为是它莫西芬耐药的潜在机制。虽然lncRNA H19参与肿瘤发生的各个阶段，但其在它莫西芬耐药性中的作用仍不清楚。为了了解H19在抗它莫西芬乳腺癌发展中的作用，今天小编给大家介绍近期发表的一篇文章。

本研究采用实时荧光定量PCR方法分析了H19在它莫西芬耐药乳腺癌组织中的表达。H19基因的下调被用来评估体内外对它莫西芬的敏感性。还通过H19的表达下调和过表达来分析自噬的状态。并采用实时定量甲基化特异性聚合酶链反应、染色质免疫沉淀、免疫荧光、Western blot等方法研究H19对它莫西芬的耐药机制。
结果：
1）自噬促进了乳腺癌细胞系对它莫西芬的耐药性
为了探讨自噬在它莫西芬耐药性过程中的作用，我们建立了抗它莫西芬MCF7细胞系（MCF7 /TAMR）。为了确认该细胞系的建立，我们进行了单层菌落形成实验（图1a）。14天后，用5或10μM它莫西芬处理后，亲代MCF7细胞存活率明显下降，而MCF7 / TAMR细胞不受它莫西芬的影响。为了研究自噬是否对它莫西芬耐药有影响，我们使用细胞样自噬检测方法分析了两种细胞系的自噬液泡，发现MCF7/TAMR细胞比MCF7细胞表现出更强的荧光信号，这表明自噬增加（图1b）。此外，Western blot结果显示，由于LC3-II表达增加，MCF7/TAMR细胞诱导自噬能力强于MCF7细胞（图1c）。另外，为了进一步验证自噬在它莫西芬耐药中的作用，我们使用了两种自噬抑制剂3-MA和CQ。用 5mM 3-MA或5μM CQ 处理14天后，细胞MCF7 / TAMR对它莫西芬的抗性减少（图1d，e）。为了排除增殖减少是否受凋亡影响，我们还比较了这些组的凋亡水平。流式细胞术检测结果显示，在对照、它莫西芬、3-MA、CQ或它莫西芬联合两种自噬抑制剂的培养基中培养24 h的MCF7/TAMR细胞凋亡水平相似（图1d，f）。这些数据表明自噬促进了MCF7/TAMR细胞对它莫西芬的耐药性。

2）H19在抗它莫西芬的乳腺癌细胞系和肿瘤组织中上调，并促进对它莫西芬的耐药性

我们分析了37例乳腺癌的临床组织，包括14例它莫西芬敏感样本和23例它莫西芬耐药样本。与它莫西芬敏感组相比，H19在它莫西芬耐药组的过表达更为频繁（图2a）。我们进一步测量了MCF7/TAMR和亲本MCF7细胞株中H19的水平。qRT-PCR结果显示，H19在MCF7/TAMR细胞中的表达水平明显高于亲本MCF7细胞（图2b）。同样 GSE26459和GSE28645数据集均表明，与它莫西芬敏感的MCF7细胞组相比，它莫西芬耐药细胞组H19表达水平显著上调（图2c）。为了确定H19在它莫西芬耐药中的作用，我们通过shRNAs沉默H19。qRT-PCR证实，与MCF7/ TAMR对照细胞相比，MCF7/TAMR-shH19细胞的RNA表达水平至少降低了80%（图2d）。然后，我们用单层菌落形成实验和CCK-8实验评估了它莫西芬的敏感性。单层细胞集落形成试验证实MCF7 / TAMR-shH19细胞形成的菌落更少（图2e）。另外，在MCF7/TAMR细胞中使用两个独立的siH19获得了相似的细胞存活率结果（图2f，g）。有趣的是，我们还产生了稳定的过表达H19的MCF7细胞，发现H19在野生型MCF7中过表达可以概括它莫西芬的耐药性（图2h，i）。最后，为了研究H19对细胞周期进展的影响，我们采用流式细胞术进行细胞周期分析。细胞周期分析显示，H19的缺失在G2/M期诱导细胞周期阻滞（图2j）。
3）H19在它莫西芬耐药乳腺癌中促进自噬活性

为了确定H19与自噬的关系，我们进行流式细胞术。发现与对照组相比，H19的下调降低了MCF7/ TAMR细胞自噬体的荧光信号（图3a）。为了确定H19的抑制是否影响MCF7/TAMR细胞的自噬通量，我们使用自噬蛋白LC3-II和溶酶体抑制剂CQ进行分析。从CQ存在下LC3-II水平升高可以看出，与对照组相比，H19沉默组自噬通量下降，说明H19的下调抑制了自噬合成（图3b）。然后，我们使用稳定的过表达MCF7/TAMR的H19细胞株进行流式细胞术。H19的表达促进了自噬体的荧光，增加了LC3-II的表达（图3 c，d）。通过过表达H19，自噬体和自溶酶体的形成均增加（图3e）。此外，我们通过敲除或过度表达H19来检测MCF7/TAMR细胞的凋亡，结果没有显著差异（图3f，g）。
4）H19通过表观遗传调控自噬相关基因Beclin1
为了确定H19调控自噬的机制，我们使用6个自噬相关基因作为假设的H19靶点。在这6个基因中，Beclin1与H19调控呈正相关（图4a，b）， Beclin1蛋白表达水平随H19敲低而降低，随H19过表达而升高（图4c）。
为了确定H19调控Beclin1表达的机制，我们检测了Beclin1启动子区域的甲基化。我们发现通过敲除MCF7/TAMR细胞中的H19，Beclin1启动子区域的甲基化增加（图4d）。Western blot分析显示，与MCF7/TAMRshH19组相比，H19/SAHH和H19/DNMT3B双敲低组Beclin1表达恢复（图4e，f）。此外，在H19/SAHH和H19/ DNMT3B双敲除组中LC3-II的表达也发生了逆转。我们还观察到两个双敲除组Beclin1启动子甲基化水平的上升（图4g）。为了进一步研究Beclin1甲基化的机制，我们进行了染色质免疫沉淀实验，发现DNMT3B与Beclin1启动子结合。H19敲除后，Beclin1启动子的免疫沉淀DNA量增加，说明DNMT3B直接与Beclin1启动子区域结合，H19敲除促进了这种相互作用（图4h）。我们还检测了临床乳腺癌组织样本中Beclin1 mRNA的表达，结果显示，抗它莫西芬组Beclin1的表达明显高于它莫西芬敏感组（图4i）。H19表达与Beclin1表达呈正相关（图4k）。

5）H19/SAHH/DNMT3B轴通过自噬参与它莫西芬耐药性

我们使用共聚焦显微镜分析自噬。与H19敲除组（MCF7/ TAMR-shH19+ shSAHH）相比，MCF7/TAMR-shH19+shDNMT3B和MCF7/ TAMR-shH19+ shSAHH的双敲除组绿色和红色荧光信号增加（图5a）。这些数据表明，SAHH和DNMT3B均参与自噬调控。此外，为了研究SAHH和DNMT3B是否影响它莫西芬的敏感性，我们进行了单层菌落形成实验和CCK-8实验。使用CCK-8法，我们发现MCF7/TAMRshH19+ shSAHH和MCF7/TAMR-shH19+shDNMT3B细胞增殖速度远快于MCF7/TAMRshH19细胞（图5b）。此外，与MCF7/ TAMR对照细胞相比，MCF7/TAMR-shH19+shSAHH和MCF7/TAMR-shH19+shDNMT3B双敲除组均形成更多更大的菌落，而MCF7/TAMR-shH19细胞形成更少更小的菌落（图5c-e）。综上所述，H19通过H19 SAHHDNMT3B轴调控自噬，进而影响MCF7/TAMR细胞对它莫西芬的耐药性。
6）在体内，H19的下调抑制自噬，克服它莫西芬的耐药性

为了进一步研究H19在体内是否影响移植瘤对它莫西芬的敏感性，我们通过皮下注射MCF7/TAMR/Tet sh-H19细胞建立裸鼠移植瘤模型，其中给予小鼠2 mg Dox诱导。与未接受Dox组相比，接受Dox组肿瘤生长明显受到抑制（图6a-c）。Dox组移植瘤中H19表达水平明显低于无Dox组（图6d）。免疫组化分析显示，与未经Dox诱导的肿瘤相比，接受Dox的肿瘤Beclin1和LC3水平下降，但P62水平升高（图6e）。Western blot结果也一致显示，与没有Dox的组相比，接受Dox的组Beclin1和LC3蛋白表达水平显著下降（图6f）。
结论：
我们通过H19/SAHH/DNMT3B轴降低Beclin1启动子区域的甲基化，证明H19表达上调可增强自噬，最终导致受体阳性乳腺癌细胞对它莫西芬的耐药性。我们认为H19是治疗受体阳性乳腺癌的潜在治疗靶点。