LncRNA新发现——HAND2-AS1促进肝癌干细胞的自我更新

关于癌症的研究一直是热门，随着技术的不断发展，研究者们已从各种方面针对癌症展开了研究。近期，一篇名为“LncRNA HAND2-AS1 promotes liver cancer stem cell self-renewal via BMP signaling”的文章在杂志 The EMBO JOURNAL上发表。
这项研究证明了HAND2-AS1促进肝脏CSCs的自我更新，促进肝脏肿瘤的发生，可能成为肝癌诊断的潜在生物标志物和HCC治疗的靶点，为如何开发针对肿瘤的长效治疗手段提供了新思路。

摘要：
肝细胞性肝癌(HCC)是最常见的肝癌，具有高复发率和异质性的特点。肝癌干细胞(CSCs)可能对这两种病理特性都有很大贡献，但对其自我更新维持的内在机制却知之甚少。在这里，我们鉴定了一种称为HAND2-AS1的长非编码RNA(LncRNA)，它在肝脏CSCs中高度表达。人HAND2-AS1及其小鼠同源物lncHand2具有较高的保守性。HAND2-AS1是肝脏CSC自我更新维持以启动HCC的发展所必需的。从机制上讲，HAND2-AS1将INO80染色质重塑复合体招募到BMPR1A启动子上，从而诱导其表达并导致BMP信号传导的激活。重要的是，通过反义寡核苷酸(ASOS)干扰HAND2-AS1的表达和通过siRNAs干扰BMPR1A的表达对人源化肝癌模型具有协同抗肿瘤作用。此外，敲除小鼠肝细胞中的lncHand2或BMPR1A可破坏BMP信号传导，并抑制肝癌的发生。我们的研究结果表明，HAND2-AS1促进肝脏CSCs的自我更新，并推动肝脏肿瘤的发生，为HCC治疗提供了一个潜在的新靶点。

技术路线：

结果：
1.HAND2-AS1在肝脏CSCs中的表达明显增加
研究者们通过芯片分析挑选了在10种CSC中上调最明显的lncRNA（图1A）。选择lncRNA HAND2-AS1为此次研究的目标，并利用原位杂交证实其在肝癌组织中高表达（图1B）。
2.HAND2-AS1缺乏对化学诱导的HCC发展的保护作用
研究者们通过将lncHand2^flox/flox小鼠与白蛋白(Alb)-Cre小鼠杂交，有条件地删除了肝细胞lncHand2。在LncHand2^+/+和LncHand2基因敲除(LncHand2^-/-)小鼠中使用二乙基胺(DEN)化学诱导肿瘤形成（图1C）。图E与图F为两组小鼠肝脏的HE染色结果和Ki67检测结果。研究者发现lncHand2-RFP肝细胞主要存在于中心静脉周围(，在DEN治疗后，lncHand2-RFP阳性细胞从中心静脉扩散到整个肝脏（图1F）。
综上所述，HAND2-AS1促进化学诱导的肝癌发展。

3.HAND2-AS1是肝脏CSC自我更新维护所必需的
HAND2-AS1缺失显著降低了HCC细胞系（图2A）和原发肿瘤细胞的初级(1)、次级(2)和第三(3)肿瘤圈形成，HAND2-AS1(Oelnc)的过表达挽救了因HAND2-AS1缺失而减少的球体形成。HAND2-AS1敲除显著降低CD13⁺CD133⁺细胞的比例（CSCs；图2B）。对不同癌细胞群进行极端极限稀释，然后将一系列肿瘤移植到免疫缺陷小鼠中，以测量它们形成继发性肿瘤的能力。HAND2-AS1缺乏会损害移植后继发性肿瘤的改建能力（图2C和D），这种差异在连续移植中增加（图2E和F）。图2G为首次移植后不同组群抽搐的估计频率。将抗Hand 2-AS1的sgRNAs导入含荧光素酶载体的Huh 7细胞（Huh7-Luc）中 ，HAND2-AS1缺失显著降低了异种移植物的原位生长，显著抑制了生物发光（图H，I）。研究者还使用反义寡核苷酸(ASOS)沉默HAND2-AS1的表达。三种不同的ASO有效地阻断了肝脏HAND2-AS1的表达，但不能阻断ASO的扰乱对照（图2J），此外，HAND2-AS1 ASOS给药显着降低了肿瘤的生长（图2K）。HAND2-AS1的过表达显著增加了肿瘤圈的形成（图2L），图M，N为在一系列有限稀释法移植过程中HAND2-AS1过表达和对照HCC细胞中TIC的估计频率。HAND2-AS1的过表达显著增强了Huh7-Luc（图2O和2P）。这些数据表明HAND2-AS1在肝脏CSC的自我更新维持中起着关键作用。

4.HAND2-AS1招募INO80复合物和INO80敲除抑制肝癌的发展
研究者们通过RNA下拉试验寻找潜在的HAND2-AS1结合蛋白。HAND2-AS1相关的INO80复合物的INO80和RUVBL2亚基与肝脏CSC相关（图3A）。Western blotting（图3B）和原代肝细胞中RNA结合蛋白的综合鉴定（图3C）证实了它们的相互作用。HAND 2-AS1与INO 80共定位于HCC肿瘤细胞的细胞核中（图3D）。图E为HAND 2-AS1的INO 80结合区的定位分析，用RNA电迁移率变化法（EMSA；图3F和G）进一步证实HAND 2-AS1片段与INO 80的结合。图H为用RNA下拉试验检测INO 80与HAND 2-AS1突变在第2外显子NT 83-242处的相互作用区域的结果。
为进一步确定INO 80在肝癌发生发展中的作用，研究者们用shRNAs方法使肝癌原发细胞中INO 80的表达减弱，INO 80缺乏对异种移植物的原位生长有明显的抑制作用，对生物发光有明显的抑制作用（图3i和J）。INO80基因敲除显着降低了化学诱导的肝肿瘤生长和数量（图3K）。这些数据表明，INO 80促进了肝脏癌的发生和肿瘤的发展。

5.HAND2-AS1将INO80复合物招募到BMPR1A启动子上启动其表达和BMP信号转导
为了鉴定HAND2-AS1的靶点，研究者们建立了HAND2-AS1和INO80耗竭的HCC原代CSC细胞，并进行了转录组芯片分析。HAND2-AS1和INO80的缺乏表现出相似的转录组模式（图4A），表明HAND2-AS1和INO80之间存在功能关系。GO分析显示当HAND2-AS1和INO80都被耗尽时，BMP信号传导中的靶基因被显著抑制（q值=0.0003；图4B），表明BMP信号传导参与了肝脏CSC的调节。
为了研究HAND2-AS1的基因组结合区，用RNA纯化(ChIRP)-seq技术对肝癌肿瘤球细胞和来自HCC原发肿瘤样本的肝脏CSC中对HAND2-AS1进行染色质分离。与LacZ对照组相比,HAND 2-AS1在肝癌肿瘤球细胞中有显著的富集峰（图4C）。ChIRPseq数据显示HAND2AS1可以结合基因组中的不同位点（图4D）。分析BMP信号的ChiRP-seq基因，发现HAND2-AS1 RNA在BMPR1A、SMAD1和SMAD9基因座上富集（图4E）。图F为肝脏CSCs中HAND2-AS1 RNA结合BMPR1A启动子的凝胶分析结果（LacZ和PVT1作为阴性对照）。
此外，HAND 2-AS1缺失抑制了BMPR1A的表达和BMP信号的激活（图4G）。图4H为BMPR1A与对照组和HAND2-AS1-敲除肝脏CSC中INO80复合物的相互作用的ChIRP免疫印迹分析结果。EMSA显示HAND2-AS1与INO80和BMPR1A启动子区域形成复合物（图4I），而INO80和HAND2-AS1的过表达并没有增强BMPR1A启动子缺失的肝细胞中BMPR1A的表达（图4J），INNO80缺乏显著抑制BMP信号（图4K）。综上所述，这些数据表明，HAND 2-AS1在BMPR1A启动子上激活INO 80复合物，启动其表达并激活BMP信号。

6.BMPR1A通过BMP信号通路促进肝脏CSCs自我更新
研究者们根据前人的研究数据分析了BMPR1A在HCC肿瘤和癌周组织中的表达——BMPR1A在肝癌中高表达（图5A），同时BMPR1A也是肝癌的理想预后预测指标（图5B），免疫组化进一步证实其在肝癌组织中的高表达（图5C）。在HCC原代细胞中沉默BMPR1A并建立稳定沉默的细胞系，可以观察到BMPR1A耗竭显著抑制了球体的形成和肿瘤的启动能力（图5D和E），BMPR1A耗尽显著减少肿瘤Huh7-Luc，显著抑制生物发光（图5F和G）。通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑在体内产生BMPR1A基因敲除小鼠，与WT相比较，Bmpr1a缺失降低了DNE治疗后的肝癌形成能力（图5H）。图I为10个月大DEN治疗的WT和Bmpr1a^-/l-小鼠肝脏切片中的代表性H&E和Ki67抗体免疫组织学染色结果。BMP抑制剂显着地减少了肿瘤层的形成（图5J）。由这些数据可以看出，Bmpr1A通过BMP信号通路促进肝CSC自我更新和肝癌的发展。

7.HAND2-AS1的Asos和抗BMPR1A的siRNAs对人源化肝癌模型具有协同抗肿瘤作用
为了研究HAND 2-AS1缺失在肝癌治疗中的作用，研究者们使用Huh7-Luc和PDX模型，重新描述了人肝癌的复杂性和表型异质性（图6A）。图6B为ASO/siRNA治疗时间表图示。与载体治疗组相比，添加ASOs的HAND2-AS1或针对BMPR1A的siRNAs可抑制肿瘤生长和肿瘤数量（图6C-F），用加扰RNA处理HAND2-AS1的ASO和/或针对BMPR1A的siRNAs获得了与载体处理组相似的结果（图6C和D）。HAND2-AS1 ASO和BMPR1A siRNAs的组合对人源化HCC模型显示了协同治疗作用（图6C-F）。HAND 2-AS1 Asos和BMPR1A siRNAs显著抑制异种移植物细胞增殖（图6G）以及HAND 2-AS1和BMPR1A的表达（图6H）。与载体处理组相比，HAND2-AS1 ASO和BMPR1A siRNAs处理延长了存活率（图6I和J）。综上可知，靶向HAND 2-AS1和BMPR1A对人源化肝癌模型具有协同抗肿瘤作用。

结论：
这项研究证明了HAND2-AS1的ASOS与针对BMPR1A的siRNAs结合可以显着降低肿瘤的生长，从而提高PDX肝癌模型的整体生存率。此外，仅应用ASOS对HAND2-AS1具有强大的抗肿瘤活性，表明ASOS靶向lncRNAs可能是肝细胞癌的潜在治疗靶点。然而，如何将基于RNA的寡核苷酸有效地传递到肿瘤中，并保持对肿瘤的长效作用，仍然需要肿瘤生物学领域的深入研究。综上所述，HAND2-AS1促进肝脏CSCs的自我更新，促进肝脏肿瘤的发生，可能成为肝癌诊断的潜在生物标志物和HCC治疗的靶点。