外泌体 miR-301a TCEAL7 Wnt/b-catenin信号通路
在'外泌体'的概念发展以前，科学家就对血清/血浆/体液中的核酸已经有了一定的研究，当时将这些核酸统称为循环核酸(Circulatingnucleic acid)。miRNA作为循环核酸中的一种，miRNA调控基因表达，exosome是细胞外运输工具递送miRNA和其他物质到达细胞周围。exosome通过受体细胞吸收，释放miRNA，是癌症发展、迁移的潜在原因之一。miRNA与靶mRNA的结合，可导致miRNA在蛋白质翻译水平上抑制靶基因表达或降解，从而靶基因引起下游信号通路的变化。这是一种常见的研究外泌体思路。所以，循环miRNA的研究一直以来都是miRNA研究的重要方向之一。
几乎所有人类实体瘤都暴露于微环境因素如缺氧，缺氧通过促进癌症和基质细胞生物学的各种变化而在肿瘤进展和对治疗的抗性中起重要作用，肿瘤缺氧是抗癌失败的主要因素。肿瘤缺氧可以降低常规疗法的有效性，例如放射疗法。7月份，X Yue等人发表一篇 “Hypoxic Glioma Cell-Secreted Exosomal miR-301a Activates Wnt/b-catenin Signaling and Promotes Radiation Resistance by Targeting TCEAL7 ”的SCI文章，发表杂志为：Molecular Therapy ，这项研究主要发现了缺氧胶质母细胞瘤（GBM）细胞释放的外泌体 exo-miR-301a通过调节Wnt/b-catenin信号通路干扰放射治疗的敏感性。
技术路线:
结果:
一、缺氧GBM细胞特异性表达和分泌exo-miR-301a
背景： HIF-1a作为缺氧标志物，可以与神经胶质瘤患者中miR-301a的表达进行比较。
目的：检测 exo-miR-301a在缺氧人GBM中的潜在功能。
图1. miR-301a被缺氧GBM细胞特异性表达和分泌，并通过外来体分泌转到含氧量正常的神经胶质瘤细胞。（A）在高HIF-1a水平的患者中观察到miR-301a高表达（B）exo-miR-301a与HIF-1a的表达正呈相关。（C）ELISA结果显示GBM细胞通过增加细胞核中 HIF-1a的水平来应对缺氧微环境变化。（D）Western印迹检测在含氧量正常或缺氧条件下GBM细胞的外泌体标志物CD9，CD63，CD81和HSP70，与常氧细胞相比，缺氧条件下细胞分泌的外泌体标志物蛋白的表达水平均升高。（E）通过纳米粒子追踪分析检测到缺氧条件下，外泌体的分泌量增多。(F,G,H) 为了研究不同条件下的 HIF-1a与miR-301a和exo-miR-301a的关系。通过缺氧和HIF-1a干扰RNA（siRNA）处理GBM细胞，缺氧条件下miR-301a和exo-miR-301a的表达显着增加；同时，HIF-1a的下调显着降低了miR-301a和exo-miR-301a的表达。总之，该文献证明了exo-miR-301a是由GBM细胞缺氧下特异性分泌并且与 HIF-1a呈正有关。
二、缺氧胶质瘤细胞的 exo-miR-301a直接靶向常氧胶质瘤细胞中的 TCEAL7
背景： TCEAL7是肿瘤抑制基因。
目的：探索miR-301a在缺氧性胶质瘤中的潜在机制，运用软件Targetscan预测miR-301a的靶基因，探索miR-301a调控靶基因 TCEAL7的机制。
检测胶质瘤患者exo-miR-301a和TCEAL7的相关性。TCEAL与miR-301a的表达水平呈负相关。
（A）miR-301a与 TCEAL7基因 3’端UTR含有两个高度保守的靶位点，第一个是结合位点。（B）As-miR-301a或NC转染pGL3-WT-TCEAL7-3 UTR-Luc和pGL3-MUT-TCEAL7-3 报告体。在常氧和缺氧条件下，用As-miR-301a转染导致TCEAL7表达显着降低。（C）蛋白质印迹分析检测用As-miRNA-301a转染后在常氧和缺氧条件下神经胶质瘤细胞中TCEAL7的表达降低。（D）荧光素酶报告基因表明与对照和常氧外泌体组相比，缺氧外泌体组荧光素酶活性降低。（D）相对于常氧条件下，缺氧GEM衍生的外泌体TCEAL7的表达降低。（E）As-miR-301a阻止缺氧外泌体对TCEAL7蛋白质下调的回复
三、在GBM恶性肿瘤中TCEAL7的表达下调
背景： 在此课题之前的研究中，在恶性胶质瘤中b-catenin高表达
（A）免疫组织化学分析显示TCEAL7的表达水平，并且随着胶质瘤恶性状态的提高而下调。（B）qPCR检测的神经胶质瘤和正常脑组织中的TCEAL7表达，TCEAL7在胶质瘤组织中的表达低于正常组织中的表达，并且随着病理分级的升高而降低。（C）Kaplan-Meier生存曲线分析了TCEAL7高表达或低表达的神经胶质瘤患者，高 TCEAL7表达患者的存活率显着高于TCEAL7表达低的患者。（D）蛋白质印迹检测TCEAL7的表达水平，与空载体（EV）相比，TCEAL7载体组中TCEAL7蛋白水平显着增加。（E）TCEAL7显着抑制胶质瘤细胞的细胞活力。（F）转染TCEAL7载体的细胞在软琼脂上形成的菌落显着少于对照组。（G）TCEAL7显著降低GBM侵袭能力。（H）TCEAL7诱导的GBM细胞凋亡。（I）建立了皮下移植瘤模型，前9天两组肿瘤大小无显着差异 ;然而，从第10天开始，与对照组相比， TCEAL7组显示出异种移植肿瘤的大小显着降低。
四、TCEAL7通过与b-catenin结合而影响b-catenin的稳定性来负调控Wnt / b-catenin途径
(A-B): TCEAL7通过与b-catenin结合却不抑制b-catenin（A和B）的稳定性来负调节Wnt / b-catenin途径。首先研究TCEAL7过表达对 b-catenin / T细胞因子（ TCF）转录活性的影响，这是由 TOP和FOP FLASH在H4细胞中进行的。添加 b-连环蛋白显着增强了TOP FLASH活性，但没有FOP FLASH活性。然而，TCEAL7的过表达以剂量依赖的方式抑制了 b-catenin刺激的TOP FLASH报告基因的激活。（C）TCEAL7的敲减促进了Wnt靶基因的表达。（D）蛋白质印迹检测TCEAL7过表达不会抑制b-catenin水平。（E）CHX追踪实验结果显示与对照细胞相比，过表达 TCEAL7的细胞中b-catenin没有显着变化。用CHX（20mg / mL）处理细胞指定的小时。（F）纯化的TCEAL7和b-连环蛋白之间的相互作用。（G）免疫沉淀测定法检查异位表达的b-catenin和TCEAL7之间的相互作用。（H）免疫沉淀测定法检查内源性b-catenin和TCEAL7之间的相互作用。（I）免疫荧光检测到b-catenin从细胞质转移到细胞核。
五、低氧胶质瘤细胞产生的exo-miR-301a向常氧胶质瘤细胞转移，并通过靶向TCEAL 7增强wnt/b-catenin信号
（A）从低氧外泌体孵育的含氧量正常的细胞中提取RNA并分析miR-301a水平。（B）从不同来源的缺氧外泌体孵育24小时（或作为对照的PBS）的含氧量正常的细胞中提取的RNA分析pri-miR-301a或pre-miR-301a的水平。（C）存在或不存在5,6-二MCB并咪唑1-bD-呋喃核糖苷（DRB）（20mM）的情况下，将缺氧分泌的外泌体喂养到含氧量正常的细胞中。24小时后，分析从受体细胞中提取的RNA的miR-301a水平。（D）用miR-301a模拟物，TCEAL7载体，As-miR-301a或si-TCEAL7处理神经胶质瘤细胞，并且TOP / FOP测定检测Wnt / b-连环蛋白信号传导的活性。（E）用As-miR-301a或TCEAL7 siRNA处理缺氧神经胶质瘤细胞，并且TOP / FOP测定检测Wnt/ b-连环蛋白信号传导的活性。（F）进行蛋白质印迹分析以评估细胞核和细胞质中b-catenin的蛋白质水平。
六、miR-301a参与低氧外泌体共培养的神经胶质瘤细胞的放射增敏作用。
目的：探究缺氧exo-miR-301a是否介导胶质瘤细胞的放射增敏作用。
（A）在 0-8Gy的剂量范围内暴露于辐射后检测细胞的存活曲线。 MTT和克隆形成结果显示,与常氧细胞相比，缺氧外泌体组呈现出辐射抗性并且辐射诱导的存活率没有显着降低。此外， miR-301a的下调或TCEAL7的增加显着增加细胞对辐射的敏感性（ p <0.01）。（B）与常氧外泌体组相比，缺氧外泌体组不能进一步抑制细胞活力;转染As-miR-301a或TCEAL7时，结果相反。（C）流式细胞实验检测miR-301a对照射后细胞凋亡的影响。（D）常氧外泌体培养组中 4-或8-Gy照射诱导的凋亡细胞百分比显着高于缺氧外泌体组，当伴随 As-miR-301a或TCEAL7时，细胞凋亡能力恢复。向量。为了促进体外实验，通过使用 U87神经胶质瘤细胞系建立皮下肿瘤以进一步评估 miR-301a在低氧胶质瘤的辐射抗性中的作用。在异种移植物生长测定中，与对照组相比，单独放射不能显着降低缺氧外泌体组中的肿瘤生长，并且通过体外检测观察到 As-miR-301a或TCEAL7载体增强肿瘤抑制的作用。（ E）qPCR以检查由 Wnt / b-连环蛋白途径转录调节的mRNA水平。Wnt / b-catenin下游基因在缺氧外泌体条件下被激活;然而，As-miR-301a或TCEAL7可显着抑制过表达。** p<0.01。