单细胞测序鉴定免疫反应的异质性

世界上没有两片相同的树叶，对于多细胞生物而言，其细胞与细胞之间也存在着差异，且不同群体细胞间的差异不一。这种差异不仅体现在形态上，也体现在遗传信息上，例如基因组信息、基因表达水平等。单细胞生物学是近几年非常热门的话题，在这一领域中，最值得一提是大规模单细胞测序（Single-cell sequencing）技术，能独立地提供每个细胞的DNA或RNA表达谱，并鉴定异质细胞群中的稀有细胞。今天小编就给大家分享一篇近期发表在nature communications上面的关于单细胞测序在免疫方面应用的文献。

技术路线：

研究成果：
1.TAK-003可产生强效持久的细胞免疫
流式细胞术评估了55个人在TAK-003免疫后第0、14、28、120天的T细胞活化程度，发现在接种后第28天时CD8+T活化(通过CD38 / HLA-DR上调评估)达到峰值,并在第120天返回基线水平。观察到CD4+ T活化峰值为疫苗接种后第14天，但此时CD8 + T无产生IFN-γ功能。

2.鉴定抗原特异性CD8 +记忆T细胞
利用单细胞RNA测序跟踪来自急性激活时间点和记忆时间的TAK-003反应性CD8 + T的克隆/收缩。IFN-γELISPOT分析TAK-003给药后第120天的PBMC样品，其表现出强偏向NS1（蛋白质非结构域）和NS3的记忆T细胞反应。NS1或NS2反应性记忆CD8 + T早期激活标志物CD25和CD69上调，流式细胞术分选CD8 + CD25 + CD69 + T，并进行单细胞RNA测序分析，疫苗接种后第120天NS1-和NS3-反应性记忆CD8 + T细胞表现出TCR克隆型多样性。

3.TAK-003刺激的CD8 + T细胞的特征
评估CD8 + CD38 + HLA-DR + T细胞的表达谱，揭示四个统计学不同的群体。与效应CD8 + T相关的基因GZMA、GZMB和PRF1等显著富集于Cluster1中，静息和naïve T相关的转录基因如CCR7、MAL和TCF7等在Cluster2、Cluster3中富集，与细胞代谢、增殖和细胞周期有关基因如TYMS，IDH2和GAPDH在Cluster1中富集。在接种120天后的1003个CD38 + HLA-DR + CD8 + T细胞中，14.5％的细胞表达NS1-和NS3-反应性记忆细胞的TCRs。表达克隆TCR的细胞优先富集在Cluster1。

4. 活化多克隆T细胞调节细胞代谢
体外刺激，CD4 +和CD8 + T细胞显示出激活标记分子上调，TCR刺激后TfR1和CD98的表达持续增，2-NBDG和BODIPY FLC16摄取增加。

5. 活化克隆T细胞调节细胞代谢
病毒 - 抗原刺激的CD8 + T的片段能观察到显著的供体 - 供体变异性，具有最丰富的CD8 + T活化响应于CMV肽刺激。除了上调CD69和CD25的表达，CD98 、TfR1的表达增加，对CD8 + T对BODIPY FLC16的摄取增加。 hCMV、腺病毒或流感内， （CD25 / CD69的上调与TfR1、CD98的表达或摄取 BODIPY FL-C16增加。有很大程度的相关性。

6.体内T细胞活化调节细胞代谢
TfR1 / CD98表达以及BODIPY FL-C16和2-NBDG摄取，用于鉴定体外抗原特异性激活的T细胞的功能表征。为确定这些标记是否可以用于剖析体内激活的疫苗反应性T细胞的功能异质性，比较了常规活化标记物CD38 / HLADR的表达和细胞摄取2-NBDG和BODIPY FL-C16的能力，和代谢转运蛋白TfR1和CD98的上调。TAK-003给药引起强效CD8 + T 应答，第28天达到峰值。与单细胞RNA测序表型一致，2-NBDG和BODIPY FL-C16摄取均显着增加。HLA-DR阳性中CD8 + T上调表达TfR1和CD98。

7.TfR1表达与效应/记忆潜能相关
为研究TfR1在体内活化的CD8 + T细胞表面表达的差异是否可用于确定它们的效应/记忆潜力，利用单细胞RNA测序来评估TAK-003给药14天后记忆前体CD8 + T克隆型的相对丰富。在接种TAK-003 14天后，分选出先前单细胞测序中使用的同一个体的TfR1 + HLA-DR + CD8 + T 并进行测序分析，117个人的TAK-003反应细胞具有80种独特的TCR克隆，其中有31和24个NS1-和NS3-反应性记忆前体细胞。只有一部分CD38 + HLA-DR +CD8 + T在TAK-003刺激后14天表达TfR1， TfR1表达与细胞增殖标记（Ki67）、细胞溶解功能（Granzyme B）和效应/记忆谱系（EOMES）存在相关。

总结：
单细胞测序技术不仅应用于免疫相关研究，在肿瘤等各领域也应用广泛，单细胞测序正在成为科研热点。