揭秘一种新的circRNA，通过海绵miRNA调节mRNA的表达进而影响膀胱癌的进展

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是世界上最流行的恶性肿瘤之一。在中国，膀胱癌的死亡率和发病率在所有泌尿系统肿瘤中排名为第一。根据肿瘤侵袭的深度，膀胱癌可分为两类：非肌肉侵袭性肿瘤（70~80％）和肌层浸润性肿瘤（20~30％）。对于肌层浸润性膀胱癌患者，转移的发生更为频繁，预后较差。即使在接受手术和化疗最佳治疗的肌肉浸润性膀胱癌患者中，由于远处转移，5年总生存率仅为60％。因此，阐明推动膀胱癌进展的分子机制具有重要的临床意义，这将有助于开发更有效的抗癌疗法。
circRNA是一类新的内源性非编码RNA分子，其基本特征为共价闭环结构，没有5'帽和3'poly尾。与线性RNA不同，circRNA通常源自外显子或内含子的反向剪接事件。反向互补序列（包括反向重复Alu对和外显子跳跃）有助于circRNA形成。circRNAs的显着特征包括强稳定性，高丰度，进化保守和组织特异性表达。尽管多年前报道circRNA，但这些分子首先被认为是剪接错误的产物。RNA测序数据的全基因组分析已经鉴定出大量的circRNA，并证明它们在哺乳动物细胞中是内源的，丰富的和保守的。近年来已经鉴定出circRNA的多种特性，由于一些circRNA具有miRNA结合位点，其作为“miRNA海绵”的作用最常被讨论。CircRNAs海绵miRNA来阻止其对靶基因的调节。然而， circRNA在膀胱癌中的作用很少被报道。膀胱癌中circRNA的生物学功能很大程度上未知，需要进一步研究。
6月份，Lu Q等人发表一篇“Circular RNA circSLC8A1 acts as a sponge of miR-130b/miR-494 in suppressing bladder cancer progression via regulating PTEN”的SCI文章，IF=10.679，这项研究鉴定了源自SLC8A1基因的circRNA，称为circSLC8A1。circSLC8A1的表达在膀胱癌组织和细胞系中显着下调，并且与膀胱癌的临床分期和分级呈正相关。这篇文献也提出了假设，即circSLC8A1可能通过海绵miR-130b和miR-494来影响PTEN的表达参与膀胱癌的进展。
技术路线:

一、circSLC8A1（hsa_circ_0000994）在膀胱癌中显着下调

图1A.circSLC8A1在膀胱癌组织和细胞系中显着下调。示意图显示了形成circSLC8A1的SLC8A1外显子1的环化。RT-PCR证实了circSLC8A1的存在，Sanger测序验证其反向剪接位点。红色箭头表示circSLC8A1的特殊剪接位点。B和CqRT-PCR实验证实了与其邻近的正常组织相比，70对人膀胱癌组织中circSLC8A1表达水平降低。D.qRT-PCR检测SV-HUC-1和膀胱癌细胞系中circSLC8A1的表达水平。E.RT-PCR在5637和T24细胞系中验证circSLC8A1的表达情况。引物扩增cDNA中的circSLC8A1但不扩增基因组DNA（gDNA），GAPDH作为阴性对照。F.qRT-PCR检测RNaseR处理或不处理后的5637和T24细胞中circSLC8A1和SLC8A1mRNA的表达情况。将circSLC8A1和SLC8A1mRNA的相对水平标准化为模拟处理中测量的值。数据是平均值±SD，n=3。

二、过表达circSLC8A1抑制膀胱癌细胞迁移和侵袭

图2 过表达circSLC8A1抑制膀胱癌细胞迁移和侵袭。A. 转染circSLC8A1或对照质粒后，qRT-PCR检测5637和T24细胞中circSLC8A1和SLC8A1mRNA的表达水平。B. wound healing实验检测在5637和T24细胞中circSLC8A1对细胞迁移能力的影响。C和D. 转染circSLC8A1或对照质粒后， transwell迁移和侵袭实验检测在5637和T24细胞中circSLC8A1对细胞迁移和侵袭能力。E. 5637和T24细胞转染两种sicircSLC8A1，qRT-PCR检测每种sicircSLC8A1对circSLC8A1和SLC8A1mRNA的干扰效率。F. wound healing实验检测在5637和T24细胞中sicircSLC8A1-1对细胞迁移能力的影响。G和H transwell迁移和侵袭实验检测在5637和T24细胞中circSLC8A1敲减后对细胞迁移和侵袭能力的影响。数据是平均值±SD，n=3。
三、circSLC8A1 充当膀胱癌细胞中 miR-130b 和 miR-494 的海绵

图 3 circSLC8A1 充当膀胱癌细胞中 miR-130b 和 miR-494 的海绵。A和B. 通过Pulldown下拉并用circSLC8A1 特异性探针富集5637， T24 和 SV-HUC-1 细胞裂解液中的 circSLC8A1，然后通过 qRT-PCR 检测circSLC8A1 的表达水平， GAPDH 用作阴性对照。C,D 和 E.通过 circSLC8A1 下拉miRNA，并且通过circSLC8A1 探针在 5637 和 T24 细胞中下拉 miR-130b 和 miR-494。 qRT-PCR 检测 5637， T24 和 SV-HUC-1细胞裂解液中 7 种 候选miRNA的相对水平。F 和 G 将生物素化的 miR-130b 或 miR-494 转染到 5637 和 T24 细胞中，链霉抗生物素蛋白捕获后，通过 qRT-PCR 定量 circSLC8A1 水平。H 和 I.免疫荧光实验检测在 T24细胞中的 circSLC8A1 和 miR-130b / miR-494 的 表达情况。细胞核染成蓝色（DAPI）， circSLC8A1 染成红色， miR-130b / miR-494 染成绿色。数据是平均值±SD，n = 3。
四、miR-130b和miR-494通过靶向PTEN促进膀胱癌进展

图 4 miR-130b 和 miR-494 通过靶向 PTEN 促进膀胱癌进展。 A和B. qRT-PCR 结果显示与正常的邻近膀胱组织相比， 在膀胱癌组织（n = 30）中miR-130b 和 miR-494的表达上调。 C和D Pearson分析显示 circSLC8A1 和 miR-130b / miR-494 的表达之间呈负相关。 E和 F CCK-8 结果实验显示 miR-130b 和 miR-494 促进 5637 和 T24 细胞的增殖。G 和 H Transwell 迁移和侵袭结果表明5637 和 T24 细胞中转染 miR-130b 或 miR-494 mimics促进细胞迁移和侵袭。I和 J. 5637 和 T24 细胞中转染 anti-miR-130b 或 anti-miR-494 抑制细胞迁移和侵袭。K.通过生物信息学分析预测 PTEN mRNA 的 3'-UTR 中的 miR-130b / miR-494 结合位点。 L.荧光素酶报告基因检测 miR-130b / miR-494 和 PTEN mRNA 之间的相互作用。M. miR-130b 和 miR-494 分别下调了 PTEN 的蛋白质表达水平。数据是平均值±SD，n = 3
五、circSLC8A1通过靶向miR-130b和miR-494调节PTEN表达并抑制膀胱癌进展

图 5 circSLC8A1 通过靶向 miR-130b 和 miR-494 调节 PTEN 表达并抑制膀胱癌进展。 A,B和 C. Transwell和 CCK-8 实验证明circSLC8A1 抑制 5637 和 T24 细胞的侵袭能力和增殖，然而用 miR-130b 或 miR-494 共转染细胞时，抑制作用被逆转。D 和 E. 蛋白质印迹显示， miR-130b 和 miR-494 可以部分降低 PTEN 蛋白的表达水平，这是由 circSLC8A1 促进的。 F. 蛋白质印迹分析 10 个配对的人膀胱癌标本和正常相邻组织样本中的 PTEN 蛋白。数据是平均值±SD，n = 3。
六、circSLC8A1抑制体内膀胱癌肿瘤的生长

图 6 circSLC8A1 抑制体内膀胱癌肿瘤的生长。A. circSLC8A1 或对照载体稳定转染的 T24 细胞的皮下注射到裸鼠中，建立皮下异种移植肿瘤（每组 n = 6）。 B. 裸鼠中异种移植物肿瘤形成的代表图。 C. 和 D. 与对照载体组相比，circSLC8A1 处理的裸鼠肿瘤生长速度和体重明显下降。E.通过 qRT-PCR 在肿瘤组织中检测circSLC8A1， miR-130b 和 miR-494 的表达水平。F. 在异种移植物中使用 IHC 染色测量 PTEN， AKT，p-AKT 和 MMP9 的表达.