重磅：Nature揭示H3K36me3介导转录过程中RNA m6A修饰
近期，m6A修饰领域大牛在nature上发表了关于RNA上m6A修饰时如何添加到特定部位的研究结果（doi: 10.1038/s41586-019-1016-7）。小编在这分享给大家，一定能对大家的研究有所帮助。
m6A是真核生物mRNA上的一种最常见的修饰，越来越多的研究揭示了m6A在mRNA稳定性、翻译，以及在细胞分化、胚胎发育、应答等过程中发挥着重要作用。m6A主要集中于含RRACH的motif上，而且主要分布于CDS和3’UTR区域。虽然体外实验中，METTL3–METTL14甲基转移酶能识别该motif，但体内只有部分motif上存在m6A，而且分布区域存在特异性。因此作者提出问题：体内特定转录本和位点的m6A修饰是如何调控的？
通过比较m6A与各种类型的组蛋白修饰的分布情况，作者发现H3K36me3与m6A的分布存在69.2%的重合（图一）。同时，在不同组织和细胞系中，SETD2(注：H3K36me3主要甲基转移酶)和METTL3、METTL14及WTAP的mRNA水平呈现正相关。因此作者猜想二者存在联系。
图1 m6A与常见组蛋白修饰分布重合分析结果
通过敲除SETD2或过表达KDM4A降低细胞内H3K36me3水平后，细胞内总RNA和poly-A RNA上的m6A修饰水平也显著降低；该降低效果与单独敲除各m6A甲基转移酶的作用一致（图2a）。小鼠模型也得到同样的结果。在SETD2敲除细胞中回复过表达SETD2可以回复H3K36me3和m6A水平（图2b）。反过来，敲低m6A甲基转移酶复合物（the m6A methyltransferase Complex, MTC）成员后对H3K36me3整体水平无显著影响。
图2 H3K36me3影响m6A水平
m6A-seq和H3K36me3 ChIP-seq结果显示了二者分部有显著的相关性。在SETD2敲除后，H3K36me3下降的区域中约有50%区域的m6A水平也显著下降。而KDM4A（H3K36me3主要去甲基化酶）过表达后，也是同样的表型。接下来作者通过核酸酶活性突变的Cas9蛋白融合表达SETD2和KDM4A，然后使用sgRNA导向特异位点实现该位点的H3K36me3改变。在原本无H3K36me3修饰的位点特异性的导入SETD2并上调H3K36me3后，该位点转录的mRNA上的m6A修饰也从无法检测变为显著上升；而导入KDM4A的结果则相反。这些结果
进一步说明了H3K36me3能上调进该部位转录本的m6A水平。
图3 位点特异修饰H3K36me3能调节对应m6A水平
敲低SETD2后，作者检测到MTC与其靶向mRNA的结合能力显著降低；而MTC基因的表达和蛋白间相互作用没有收到影响。因此作者推测H3K36me3能够招募MTC至相应部位。作者进一步研究发现H3K36me3能直接与MTC结合，而且不依赖于RNA或DNA。而且MTC只特异性的结合H3K36me3，而不结合H3K36me1和H3K36me2。MTC中，METTL14负责识别H3K36me3。那这种识别是否是直接相互作用呢？作者没有发现已知的H3K36me3 reader能与METTL14相互作用，但在体外实验中作者检测到了H3K36me3和METTL14之间的直接相互作用。截断实验也进一步分析了METTL14识别H3K36me的核心区域。如图4所示。
图4 METTL14与H3K36me3作用机制研究
既然METTL14能结合H3K36me3，那它是否与染色质结合呢？作者使用HA标签抗体通过ChIP-seq检测了METTL14在染色质上的定位，而这一分布与H3K36me3有显著的相关性。而PAR-CLIP检测METTL14在RAN上的分布也于该结果一致。如图5所示。
图5 METTL14和染色质和RNA定位与H3K36me3和m6A相关性分析
文献报道中，H3K36me3参与的功能较多，其中包括转录延伸。作者探讨了POII S2P在METTL14调节这一过程中的作用。最后得出结论：METTL14能直接识别和结合H3K36me3而不依赖于POII S2P，进而在POII介导的转录延伸过程中直接甲基化新生RNA（图6）。最终，作者在胚胎干细胞的更新和分化过程中探究了这一分子机制的生物学意义。通过敲低SETD2降低H3K36me3水平后，胚胎干细胞中m6A水平和分化状态都显著下降。
图6 METTL14在转录过程中识别H3K36me3并催化m6A模式图
图7 下调H3K36me3能减少m6A水平和抑制小鼠胚胎干细胞分化
该研究不仅系统地揭示了m6A主要分布于CDS和3’UTR区域的分子机制，更是发现了染色质上的组蛋白修饰与RNA上的修饰存在调节关系。这为我们研究基于表达调控提供了新的思路。