LncRNA NEAT1与多发性骨髓瘤

   长非编码RNA在多发性骨髓瘤（MM）中的生物学作用和治疗潜力是一个尚需研究的问题。针对NEAT1沉默的研究可以为抗MM的治疗方法提供新的思路。 近日，一篇名为“Long non-coding RNA NEAT1 targeting impairs the DNA repair machinery and triggers anti-tumor activity in multiple myeloma”的研究向我们展示了最新的研究结果。

技术路线：

   与正常骨髓浆细胞相比，NEAT1在MM和PCL患者中过表达。将NEAT1表达分析扩展到具有代表性的广泛的人类血液肿瘤，包括MM(n=20)，淋巴瘤(n=8)和白血病(n=7)细胞系。按照之前描述的基于定量实时PCR的方法，发现在人骨髓瘤细胞系（HMCL）中NEAT1的全局表达比在其他肿瘤细胞系中高出约六倍（图1）。

   据报道，g#N1可以使NEAT1沉默。研究者使用亚细胞毒性浓度（5µM）评估g#N1_E传递的时间依赖性效应。如图2a所示，NCI-H929和AMO-1细胞系中g#N1_E传递显著下调了两种NEAT1亚型的表达，导致lncRNAs沉默4天后细胞活力降低（图2b，c）。基于BM对MM肿瘤细胞的支持作用，接下来在BM环境下测试了NEAT1的沉默。如图2d所示，g#N1_E处理也抑制了NCI-H929和AMO-1细胞系与HS-5细胞共培养时的生长和生存。这些数据表明，NEAT1靶向可能能够克服BM环境对MM细胞的增殖和促进生存的影响。体内实验证实，通过使用从g#N1_E的体外活性衍生的治疗计划，并基于为类似的LNA ASO设计的方案，可以发现g#N1_E减少了AMO-1异种移植物的生长（图2e）。最后，评估裸露的g#N1_E对来自MM患者的CD138+细胞的抗MM作用。在g#N1_E暴露6天后，NEAT1下调导致明显的细胞死亡，证实了对HMCL的影响（图2f）。

   对NEAT1耗尽的MM细胞进行细胞周期分析。如图3a所示，在NEAT1敲除6天后，测量到细胞周期相位分布的强烈调整。此外，细胞荧光分析也显示在两种细胞系中S期减少，这进一步证实了BrdU摄取减少（图3b）。在NEAT1沉默5天后，通过流式细胞术、western blot分析和caspase-3和-7活性测定分析NEAT1对细胞凋亡的影响。流式细胞术分析显示，与相对阴性对照相比，AMO-1，NCI-H929，沉默细胞的凋亡率显著增加（图3c）。WB法测定caspase 3和7裂解，结果显示在NEAT1沉默后PARP裂解（图3d）。在体内也观察到了减少的增殖和凋亡特征，NEAT1KD既增加了caspase-3，又减少了AMO-1异种移植细胞的Ki67染色（图3e）。NEAT1耗尽也在MM患者衍生的肿瘤中触发caspase3和7切裂解（图3f）。

   为了确定MM中NEAT1下游相关通路，对NEAT1耗竭后NCI-H929和AMO-1的基因表达谱分析。在用g#N1_E LNA-gapmeR处理96小时的不同HMCL和其他血液肿瘤中，通过qRT-PCR验证了五个基因的调节。只有表现出生物学反应的细胞系(就降低的活性而言)在g#N1_E LNA-gapmeR给药后也表现出这些基因的下调（图4a）。对从AMO-1小鼠移植瘤细胞中提取的RNA进行的qRT-PCR分析证实，在g#N1_E LNA-gapmeR给药后，这些基因下调，用g#N1_E LNAgapmeR处理48小时的原代肿瘤细胞分析也证实了这些发现（图4b）。。
   聚焦于这些途径，可以发现RAD51蛋白随着激酶蛋白CHK1和Chk2的磷酸化部分的降低而减少，这些蛋白都参与了DNA损伤检查点；发现RPA32和BRCA1的活性量下调，这两种蛋白分别是DNAdamage传感器蛋白和DNA修复机制的必要效应器（图5a）。
为了评估NEAT1沉默引起的DNA修复过程的假设损伤是否与DNA损伤增加相关，评估当DNA损伤发生时被磷酸化的H2A.X蛋白的表达和模式分布。如图5b的WB所示，NEAT1下调导致遗传毒性应激增加。接下来研究了Oaparib（一种PARP抑制剂，在HR缺乏的肿瘤中诱导合成致死性）在NEAT1耗竭细胞中的作用。在NEAT1存在或不存在的情况下增加了这种药物的浓度，处理了AMO-1和NCI-H929，然后评估每个样品中的细胞存活，g#N1_E LNA-gapmeR与olaparib的组合在几乎所有的测试组合中都产生了协同效应（图5c）。

   为了评估NEAT1在MM细胞耐药机制中的作用，评估与MM治疗的最常用药物，即Bortezomib，Carfilzomib和Melphalan的协同效应的发生情况。为此，用存在或不存在NEAT1 gapmeR的不同浓度的每种药物处理NCI-H929和AMO-1细胞系，然后评估每个样品中的活细胞。结果，g#N1_E LNA-gapmeR与carfilzomib、melphalan或bortezomib的组合产生了协同效应（图6a）。

   为了深入了解NEAT1抑制与卡非罗米和硼替佐米联合使用的协同作用，将蛋白酶体抑制剂通过靶向ssDNA/RPA32信号中间体来破坏同源DNA重组。基于g#N1_E LNA-gapmeR诱导的RPA32活性量的下调（图5a），评估了结合蛋白酶体抑制剂和NEAT1反义寡核苷酸对pRPA32的影响。如图6b，与各单独处理相比，卡非唑米和硼替佐米联合NEAT1抑制进一步降低了pRPA32在NCI-H929和AMO-1中的比例。