环状AKT3 RNA编码的蛋白抑制胶质母细胞瘤的致瘤性
胶质母细胞瘤(GBM)是最致命的肿瘤之一，尽管治疗手段多样，但是GBM患者的中位生存时间仅为12-14个月。近日，来自中山大学附属第一医院的研究团队在Molecular Cancer上发表了一篇题名为：A novel tumor suppressor protein encoded by circular AKT3 RNA inhibits glioblastoma tumorigenicity by competing with active phosphoinositide-dependent Kinase-1的文章。该文章主要讲述了circRNA Circ-AKT3编码的蛋白通过与活化的PDK1竞争来阻断AKT thr-308磷酸化，达到抑制GBM细胞的增殖，抗辐射性和致瘤性。
一、Circ-AKT3在GBM样品和细胞系中低表达
对GBM癌和癌旁组织进行circRNA测序，GBM癌组织中3363个circRNA表达上调，3072个下调。三个circRNA-AKT3（hsa_circ_0017250，hsa_circ_0112784和hsa_circ_0112781）在测序数据中发现，只有hsa_circ_0017250含有完整ORF。肿瘤组中hsa_circ_0017250（circ-AKT3）的水平明显低于正常组，因此选取circ-AKT3进行后续研究。
Circ-AKT3由AKT3基因的第3外显子到第7外显子生成，全长524 nt，PCR产物和Sanger测序证实了Circ-AKT3圆形结构。与线性形式的AKT3 mRNA相比，CIRC-AKT3在RNA酶作用下具有更长的半衰期。FISH结果表明，CIRC-AKT3在星形胶质细胞（NHA）的细胞质中，核质分离PCR结果验证这一结论。利用Northern印迹检测过表达的circ-AKT3或加circ-AKT3 shRNA转染的NSC和NHA细胞中的circ-AKT3的表达。通过qRT-PCR方法在患者组织和细胞系中验证circ-AKT3和线性AKT3 RNA表达水平，与NSC和NHA细胞相比，GBM和GICs细胞表达的circ-AKT3水平较低。线性AKT3的mRNA有在GBM细胞和临床样品中低表达。
二、Circ-AKT3编码174个氨基酸（aa）的新蛋白AKT3-174aa
CIRC-AKT3具有预测的ORF，可以通过使用包含起始和终止密码子“UAAUGA”的片段编码174个氨基酸的蛋白质。使用双荧光素酶检测CIRC-AKT3的IRES活性，在IRES的驱动下，174个氨基酸的产物涵盖了与AKT3蛋白相同的62–232氨基酸序列，并带有一个特殊的“Ans Ala Ser”C端。使用的抗体结合AKT3蛋白的中间部分，抗体可以识别AKT3和AKT3-174aa。AKT3-174aa在GBM细胞和组织中低表达。使用CIRC-AKT3的过表达质粒，证实174个氨基酸的预测的蛋白通过CIRC-AKT3编码。再低CIRC-AKT3表达的细胞系中转染circ-AKT3和线性化的AKT-174aa质粒，均产生了预测的AKT-174aa条带。与此相反，在两个shRNA敲低CIRC-AKT3的NHA细胞中，AKT3-174aa表达减少，不影响线性AKT3的mRNA编码的蛋白表达。SDS-PAGE电泳后使用质谱技术确定了AKT3-174aa肽段的分子量。这些结果证明，circ-AKT3编码这种174个氨基酸的新蛋白，我们称之为AKT3-174aa。免疫荧光结果显示，AKT3-174aa在U251细胞的细胞质中存在。在临床样本中，AKT3-174aa表达与GBM患者的预后呈负相关，线性AKT3的表达水平与GBM患者总体存活的物相关性。这表明AKT3-174aa可以是用于GBM患者的预后标志物
三、AKT3-174aa作为抑制恶性表型的GBM肿瘤抑制剂
在SW1783和Hs683神经胶质瘤细胞系中circ-AKT3的敲低只能减少AKT3-174aa的表达，而不减少AKT1，AKT2和AKT3的表达。在U251和U373细胞中过表达circ-AKT3，只增加现行AKT3-174aa的表达，并不影响AKT1，AKT2和AKT3的表达。并且过表达circ-AKT3的U251和U373细胞增殖能力减弱，敲低CIRC-AKT3促进SW1783和HS683细胞生长。在克隆形成实验中AKT3-174aa与细胞集落形成呈负相关。AKT3-174aa过表达增强了GBM细胞放射敏感性，AKT3-174aa敲低加强星形细胞瘤细胞的放射不敏感性。这些数据结果支撑了AKT3-174aa的肿瘤抑制的作用。
四、AKT3-174aa发挥生物学功能
为了进一步验证AKT3-174aa而不是circ-AKT3发挥上述功能，使用线性化AKT3-174aa质粒在稳定敲除circ-AKT3的SW1783和Hs683细胞中恢复AKT3-174aa的表达。AKT3-174aa的表达逆转由CIRC-AKT3稳定敲除引起的恶性表型。相反，过表达起始密码子突变的CIRC-AKT3，并不能抑制U251和U373细胞增殖，集落形成和放射不敏感等恶性表型。以上结果证明AKT3-174aa在GBM中发挥了肿瘤抑制作用，而不是circ-AKT3。
五、AKT3-174aa抑制AKT Thr308的磷酸化
为了研究AKT3-174aa参与的分子机制，对稳定表达circ-AKT3和circ-AKT3 IRES-mut（突变）质粒的U251和U373细胞进行RNA序列分析。在U251和U373中分别检测到共1873和2471个差异表达基因（DEG）。DEGs和KEGG分析均显示出与癌症相关途径的显着关联，包括PI3K-Akt信号通路，TNF信号通路，MAPK信号通路等。由于AKT3-174aa与AKT3共享一段相同的序列，因此首先检查了AKT3-174aa过表达或敲低细胞中AKT亚型的激活。AKT3-174aa不影响总AKT1，AKT2或AKT3的mRNA或蛋白质的表达水平；AKT3-174aa抑制AKT-的Thr308但不抑制AKT-Ser473的磷酸化。
在人GBM中，AKT激活通常与PTEN交替相关，在AKT3-174aa过表达的U251和U373细胞和在AKT-174aa稳定敲除的SW1783和Hs683细胞中，未发现p-EGFR（thr1068）发生变化。在PTEN野生型SW1783和HS683细胞中，PTEN表达也未AKT3-174aa敲低影响。AKT3-174aa的过表达减少了AKT2和AKT3的thr-308磷酸化，但没有降低ser-473的磷酸化，这表明AKT3-174aa的影响大于AKT3。这些结果表明AKT3-174aa在p-AKT上游发挥作用，而不是影响AKT亚型本身。尽管PDK1或p PDK1表达不受AKT3-174aa的影响，但是通过使用质谱发现p PDK1是AKT3-174aa免疫沉淀复合物的潜在相互作用蛋白。在IP实验中，Flag标记AKT3-174aa可能与p PDK1相互作用。虽然pulldown实验并没有结果，但是在体外IP实验中GST-AKT3-174aa与His-PDK-1可以相互作用，这进一步证实这AKT3-174aa PDK-1互动与激活。在荧光双染中AKT3-174aa 与PDK-1共定位，表明这表明AKT3-174aa通过与对p PDK1相互作用以抑制AKT的THR-308。
六、AKT3-174aa是AKT的天然显性负调节变体
由于AKT3-174aa与AKT3在62-232位氨基酸共有相同的序列，AKT3-174aa可能与AKT亚型竞争与p-PDK1结合。过表达AKT3-174aa后p-PDK1的活性显著抑制。此外，AKT激酶活性在U251和U373 AKT3-174aa过表达细胞中被抑制，而在SW1783和HS683 AKT3-174aa稳定敲低细胞活性增强。剂量依赖性转染CIRC-AKT3进入U251细胞，并用AKT2，AKT3和对PDK1进行免疫沉淀。随着AKT3-174aa的表达增加，P-Thr308在AKT2和AKT3的IP均降低。在剂量依赖性敲低的SW1783细胞行中结果相反。结果表明，AKT3-174aa是蛋白质诱饵，通过显性负调控限制P-AKT的异常活化。
七、AKT3-174aa在体内抑制GBM致瘤性
在小鼠颅内肿瘤模型中测试AKT3-174aa的肿瘤抑制作用。AKT3-174aa过表达显著提高小鼠模型的总生存时间，与之相反敲低AKT3-174aa促进体内肿瘤形成。在小鼠异种移植肿瘤中，AKT3-174aa过表达与p-AKT-thr308的表达水平负相关；这支持了AKT3-174aa抑制AKT活化诱导的恶性表型。总之结果表明，AKT3-174aa是GBM肿瘤发生过程中PI3K / AKT信号传导的关键负调节。
结论：
Circ-AKT3是新鉴定的AKT3转录变异体。Circ-AKT3编码AKT3-174aa，与p-PDK1相互作用。Circ-AKT3和AKT3-174aa在GBM中低水平表达，可以更容易地诱导AKT-thr308磷酸化和p-PDK1的激活。恢复AKT3-174aa的表达可在体外和体内抑制GBM的细胞增殖，存活和致瘤性。作为PI3K / AKT信号的新型负调节剂，AKT3-174aa是GBM患者的潜在预后标志物。