新技术—不使用抗体的m6A测序技术

   美国杜克大学医学院的Kate D. Meyer取得一项新进展。研究人员开发了一个名为DART-seq的技术，该方法能够不使用抗体来对全局的m6A修饰进行检测。相关论文“DART-seq: an antibody-free method for global m6A detection” 于2019年9月23日在线发表于《自然—方法学》, IF= 28.467。
   原理：在DART-seq中，胞苷脱氨酶APOBEC1与m6A结合的YTH结构域融合。细胞中APOBEC1-YTH的表达可在与m6A残基相邻的位点诱导C-U脱氨，可使用标准RNA序列检测到。 DART-seq可从低至10ng的总RNA中识别出细胞中的数千个m6A位点，并可随时间检测细胞中m6A的积累。此外，研究人员使用长读本的DART-seq来深入研究了m6A沿单个转录本长度的分布。
   研究人员表示，改变甲基化位点附近序列的策略将能够通过标准RNA-seq检测m6A，从而克服了当前方法的主要局限性，APOBEC1是一种胞嘧啶脱氨酶，其靶向DNA和RNA以诱导胞嘧啶-尿嘧啶（C-to-U）编辑。尽管最初发现它具有编辑ApoB mRNA的能力，但是APOBEC1自此被用于基于CRISPR–Cas9的基因组编辑方法中，以在目标单链DNA位点诱导C-U转换。我们推测，可以通过将APOBEC1与m6A结合的YTH域融合并用RNA-seq检测随后的编辑事件，采用类似的策略来编辑RNA中的m6A邻近胞苷。在这里，我们展示了这种方法的实用性，可使用转录组范围的作图法以低至10ng的总RNA作为输入来检测细胞RNA中的m6A位点。我们的策略综述了基于抗体的甲基化RNA检测方法，并提供了对单个转录亚型中m6A残基聚类的见解。这种方法大大改善了与全局m6A检测相关的时间和成本，并将能够在有限的RNA样品中进行转录组范围的作图。
一、制定有针对性的脱氨策略以检测m6A

   开发用于m6A检测的无抗体方法。m6A的首先选用共有序列包含紧接m6A位点的恒定胞苷残基（Rm6ACH，其中R = A或G； H = A，C或U），作者推测将APOBEC1募集到m6A位点将使m6A残基紧接着的胞苷脱氨。为了测试这一点，我们将APOBEC1与YTHDF2的m6A结合YTH域融合。然后将APOBEC1-YTH融合蛋白与含有单个内部腺苷的合成RNA孵育。反转录和Sanger测序表明在甲基化RNA中紧接m6A后立即对胞苷进行频繁编辑，而在未甲基化RNA中则不是如此（补充图1a）。APOBEC1与YTH域融合，以指导在m6A位点附近的胞苷残基上进行C-to-U编辑。DART-seq方法的示意图。APOBEC1-YTH在细胞中表达，分离出总RNA并进行RNA测序。然后检测到C到U突变以鉴定m6A的位点。

二、DART-seq可识别整个转录组中包含m6A的RNA

A:饼状图，显示了表达 APOBEC1-YTH（左）和 APOBEC1-YTHmut（右）的细胞中不同转录本区域中 C-U 编辑位点的分布（每个 n = 3 个独立样本）。B: Metagene 分析显示了 DART-seq 检测到的 C 到 U 编辑事件分布的密度图。结果代表三个独立实验。C:在表达 APOBEC1-YTH（n = 39,069）， APOBEC1-YTHmut（n = 21,841）或单独 APOBEC1 的细胞中，在 C-U 编辑位点周围的± 4-nt 区域内发现的最丰富的基序（ n = 6,814）。使用累积二项式分布来计算单个基序富集的 P 值。 D: DART-seq 数据的整合基因组学查看器（IGV）浏览器跟踪，这些数据在 JUN 和 EEF2 mRNA 中表达所示的构建体。在至少 10％的读数中发现的 C 到 U 突变由金色/绿色表示（金色表示 C 位点的丰度，绿色表示每个位置的 U 位点的丰度；两个基因均从负链转录） 。由 MeRIP-seq（蓝色轨道）标识的 m6A。结果代表三个独立实验。 E:在 ACTB 位点的 DART-seq 读取覆盖率。在至少 10％的读数中发现 C 到 U 突变由单个位点的金色/绿色表示（金黄色表示 C 位点的丰度，绿色表示每个位置的 U 位点的丰度； ACTB 指从阴性位置转录）。

三、DART-seq监测 m6A 随时间的变化情况

A:与未经处理的对照（UT； n = 40,594）相比， DART-seq 在经 CPT 处理的 HEK293T 细胞（n =5,689）中发现的 C 至 U 突变的分布。 ** P <0.0001。 B-C: IGV 浏览器图像显示了 CPT 处理后 BPTF（b）和 ATRX（c）转录本的 CDS 中的C 到 U 突变。在至少 10％的读数中发现的 C 到 U 突变由蓝色/红色（C / U）着色表示BPTF 转录本（正链），以及 ATRX 转录本（负链）中的金/绿（C / U）着色。 CPT 处理后富集的 C-U 站点由紫色三角形表示。 n = 2 个独立样本。D: MeRIP-RT-qPCR 证实了 CPT 处理后 BPTF 和 ATRX mRNA 中 m6A 的富集。E: 使用未经处理和经 CPT 处理的细胞中的 RNA 进行的 RT–qPCR 分析显示，经过 CPT 处理后， BPTF 和 ATRX 转录本的丰度降低。

四、长时间阅读的 DART-seq 显示了单个 RNA 分子中的 m6A 分布

   长时间阅读的 DART-seq 显示了同工型特异性甲基化模式。基于免疫沉淀的 m6A 检测策略先前已报告了 m6A 位点的聚类 3–5.但是，尚不清楚这是否反映了 m6A 在相同或不同的 RNA 分子上的聚集。由于 DART-seq 诱导单个转录本中的编辑事件，因此我们认为可以检查单个测序读数以确定在同一 RNA 分子中是否存在 m6A 位点。为了对此进行调查，我们使用 PacBio 平台进行了长时间读取的 DART-seq。单个 mRNA 的检测表明，尽管某些转录本表现出同工型特异性区域编辑，但其他转录本在5'UTR， CDS 和 3'UTR 中包含 DART-seq 位点。此外，有 41％的读取至少跨越两次。