m6A甲基化与肥胖治疗

   m6A在脂肪发生过程中起着重要作用。然而，其机制在很大程度上仍不清楚。在这里，小编与大家分享一篇近期发表于AUTOPHAGY的文章“m6A mRNA methylation controls autophagy and adipogenesis by targeting Atg5 and Atg7”。我们证明了m6A通过靶向Atg5和Atg7在调控自噬和脂肪生成方面发挥着关键作用。机制上，众所周知的m6A去甲基酶FTO的下调降低了ATG5和ATG7的表达，导致自噬体形成的衰减，从而抑制了自噬和脂肪生成。

结果：
1.FTO促进自噬，进一步促进脂肪生成

   为了探索FTO在自噬中的作用，我们首先对3T3-L1细胞进行了功能缺失的研究。western blot实验表明，与对照细胞相比，FTO沉默显著降低了LC3-II:I比值，增加了SQSTM1水平，表明自噬体形成缺乏稳态（图1A）。相反，HA标记的FTO过表达显著提高了LC3-II:I比值，减少了SQSTM1表达，表明FTO与自噬呈正相关。此外，免疫荧光检测显示，HA-FTO过表达后形成较多的LC3小点（图1B，C）。我们用透射电镜分析了脂肪形成过程中自噬体的形成。发现FTO的沉默降低了自噬体的数量，表明自噬的激活程度降低。相反，FTO的过表达增加了细胞内自噬体的数量（图1D，E）。为了确定自噬是否受FTO过表达的影响，对照组和过表达的细胞分别使用或不使用其他自噬抑制剂治疗。这进一步证实FTO促进自噬激活（图1F，G）。
为了探讨FTO是否通过自噬途径影响脂肪生成，在脂肪生成过程中，对照组和FTO过表达的3T3-L1和猪前脂肪细胞分别使用或不使用自噬抑制剂。我们观察到3-MA和 Baf A1治疗可以逆转增强的自噬，脂肪形成和FTO过表达细胞的甘油三酯积累（图1H-J）。与表型一致，脂肪细胞标记的mRNA和蛋白水平包括Pparg，Fabp4和Cebpa在FTO过表达细胞明显升高，通过3-MA或Baf A1处理可将FTO下调至正常水平（图1K，L）。这些结果表明FTO通过促进自噬促进脂肪细胞分化。

2.FTO的下调降低了ATG5和ATG7的表达，但没有降低ULK1的表达
   为了确定自噬中FTO的潜在靶基因，我们首先利用qPCR分析比较FTO敲低后自噬相关基因的mRNA表达情况。结果显示，在FTO敲除后，Atg5和Atg7的mRNA水平显著降低，而Ulk1没有变化（图2A）。另外，FTO的下调显著下调了ATG5和ATG7蛋白水平。相反，我们发现ULK1和其他自噬相关蛋白，如ATG12和ATG16L1，并没有发生显著的变化（图2B）。此外，我们检测了ATG5和ATG7在脂肪细胞分化过程中的表达谱，发现他们两个都在早期增加，然后下降（图2C）。这些数据表明，Atg5和Atg7可能是FTO的靶基因。
为了检测ATG5和ATG7对自噬和脂肪生成的影响，我们分别用ATG5和ATG7 siRNA处理3T3-L1前脂肪细胞，并使用western blot检测其敲除效率。结果表明，LC3II:I的比值在ATG5和ATG7基因敲除后下降，FTO蛋白表达未发生变化（图2D，E），这与FTO与ATG5、ATG7的上游下游关系一致。此外，我们发现，与对照组相比，FTO、ATG5和ATG7的缺失均显著抑制脂肪生成和甘油三酯积累（图2F-H）。而且FTO、ATG5或ATG7敲低均下调了脂肪细胞标记基因的表达水平（图2I，J）。这些结果表明ATG5和ATG7对3T3-L1前脂肪细胞的自噬和脂肪生成具有重要的功能。因此，我们将重点放在这两个FTO的潜在目标Atg5和Atg7上进行进一步的研究。

3.FTO通过靶向ATG5和ATG7影响自噬和脂肪生成
   为了证实FTO是否通过影响ATG5和ATG7的表达而影响自噬和脂肪生成，我们首先验证了FTO的过表达显著提高了ATG5和ATG7的mRNA水平（图3A）。接下来，我们进行了抢救实验，观察到沉默ATG5可以逆转FTO过表达3T3-L1细胞中上调的LC3-II:I比值（图3B）。与ATG5相似，ATG7缺失也恢复了扩增的LC3-II:I比值（图3C），表明FTO通过调控ATG5和ATG7表达影响自噬。已有研究报道，ATG5和ATG7在前脂肪细胞中的下调通过抑制PPARG和CEBPA的表达，抑制自噬，降低CEBPB的水平，阻碍脂肪分化计划的启动。这增加了FTO通过Atg5和Atg7-Cebpb信号调控脂肪生成的可能性。如我们所料，我们发现FTO的强制表达促进了CEBPB蛋白的表达，而ATG5和ATG7的缺失则逆转了CEBPB的表达（图3D）。此外，敲低ATG5 和ATG7可恢复FTO过表达促进的3T3-L1细胞的脂肪生成和甘油三酯积累（图3 E-G）。FTO过表达细胞中Pparg、Fabp4和Cebpa 的表达水平的升高也被逆转（图3H，I）。总的来说，FTO通过介导Atg5和Atg7-Cebpb信号轴促进脂肪生成。

4.FTO以m6A依赖的方式调控ATG5和ATG7表达
   为了进一步阐明FTO在自噬调控中的潜在分子机制，我们构建了野生型（FTO- wt）和催化突变体FTOR96Q （FTO- mut）质粒，以确定是否需要FTO的去甲基酶活性。液相色谱串联质谱证实FTO-WT或FTO-MUT异位表达对细胞m6A水平的影响（图4A）。体外表达的FTO-WT显著增加了3T3-L1和猪脂肪细胞的LC3-II:I比值（图4B），这意味着FTO以去甲基化酶活性依赖的方式调节自噬。一致的是，表达FTO-WT的细胞在免疫荧光检测中显示LC3斑点显著增强（图4C，D）。此外，与FTO-MUT或空载体相比，FTO-WT的异位表达增加了自噬体的数量（图4E，F）。这些结果表明，FTO的去甲基化活性是前脂肪细胞自噬所必需的。接下来，我们研究了FTO是否通过去甲基化影响ATG5和ATG7的表达。与FTO-MUT或空载体相比，体外表达的FTO-WT增加了ATG5和ATG7的蛋白和mRNA水平（图4G）。另外，在Atg5和Atg7的3’UTR处发现m6A修饰（图4I）。我们发现，通过敲低FTO可以增加3T3-L1和猪前脂肪细胞的m6A水平（图4J）。此外，MeRIP-qPCR检测显示，FTO敲除显著提高了Atg5和Atg7 mRNA转录本的m6A水平（图4K）。我们用RIP-qPCR，观察到Atg5和Atg7分别与3T3-L1中HA标记的FTO和猪前脂肪细胞中FLAG标记的FTO相互作用，提示Atg5和Atg7是FTO的直接靶点（图4L）。更重要的是，为了评估m6A对靶标mRNA的修饰是否对FTO介导的基因调控是必要的，我们对3T3-L1细胞进行了双荧光素酶报告基因和诱变实验。FTO-WT的强制表达显著促进了Atg5和Atg7的野生型3’UTR片段的活性（图4M）。当m6A位点发生突变时，这种增加被消除，说明FTO通过m6A依赖方式调控ATG5和ATG7的表达。此外，染色分析显示，FTO- WT促进脂肪细胞分化和甘油三酯积累（图4N，P），证实FTO的去甲基化活性是脂肪生成所必需的。

5.YTHDF2通过m6A依赖机制介导ATG5和ATG7的稳定性和表达
   为了进一步解释m6A甲基化与FTO靶基因蛋白丰度之间的负相关关系，我们首先研究了ATG5和ATG7的表达是否受到YTHDF2或YTHDF1的影响。与对照组相比，YTHDF2的过表达显著降低了ATG5和ATG7蛋白水平（图5A）。而YTHDF1的强制表达对ATG5和ATG7的表达无影响（图5B），说明ATG5和ATG7是YTHDF2的靶点。另外，通过RIP-qPCR检测，我们进一步证实了Atg5和Atg7在3T3-L1和猪前脂肪细胞中都与标记为FLAG的YTHDF2相互作用（图5C）。接下来，我们测试了Atg5和Atg7 mRNA上的m6A修饰是否对YTHDF2介导的基因调控至关重要。双荧光素酶检测显示异位YTHDF2显著下调携带野生型Atg5和Atg7片段的荧光素酶活性（图5D）。为了研究YTHDF2是否通过介导mRNA的衰减来控制Atg5和Atg7的表达，我们对3T3-L1细胞进行了功能缺失研究。与对照细胞相比，YTHDF2的敲低提高了Atg5和Atg7的mRNA水平（图5E）。mRNA稳定性分析显示，YTHDF2的缺失延长了Atg5和Atg7 mRNA转录本的半衰期（图5F）。此外，通过强制表达YTHDF2，可以部分逆转FTO过表达3T3-L1时ATG5和ATG7蛋白水平的升高（图5G）。YTHDF2过表达也部分逆转了FTO过表达细胞中LC3-II:I比值的升高。此外，异位表达YTHDF2可以逆转FTO过表达导致的脂肪生成和甘油三酯积累（图5H-J）。

6.FTO可降低小鼠白色脂肪量，抑制ATG5和ATG7依赖的自噬
   为了研究FTO在体内脂肪组织中的作用，我们将Ftoflox/flox小鼠与Fabp4-Cre小鼠杂交，建立了脂肪选择性FTO敲除小鼠（FTO-ako）模型。FTO-ako小鼠的白色脂肪组织中FTO的表达被有效地删除（图6A）。与胎鼠对照小鼠相比，fto-AKO小鼠不受普通饲料或高脂饮食（HFD）诱导的体重增加的影响，而两组之间的食物摄入量没有显著差异（图6B，C）。与对照组小鼠相比，fto-AKO小鼠取食普通食物和高脂饮食上都明显变瘦（图6D）。另外，fto-AKO小鼠的腹股沟脂肪和性腺脂肪垫的质量分别显著低于对照组小鼠（图6E，F）。haematine和伊红染色显示，取食HFD的小鼠脂肪细胞具有典型的结构，几乎整个细胞被一个大的脂滴所占据（图6G，H）。相反，FTO缺乏会导致多腔和较小的脂肪细胞。此外，喂食HFD的fto-AKO小鼠的血糖水平和血清甘油三酯水平明显低于对照组小鼠（图6I，J）。为了研究FTO是否影响体内自噬，我们首先检测了对照组和FTO-ako小鼠WAT中LC3-II:I和SQSTM1的表达水平。有趣的是，脂肪选择性缺失的Fto显著减弱了LC3-II:I比值，增加SQSTM1蛋白丰度（图6K）。与体外研究一致，FTO缺乏减少ATG5和ATG7的蛋白和基因表达（图6K，L）。综上所述，这些结果表明，脂肪细胞选择性敲除fto可以降低WAT的量，并抑制ATG5和ATG7依赖的小鼠自噬。

 

总结：
   我们的研究表明，FTO在m6A-YTHDF2依赖机制中，在促进自噬和脂肪生成方面发挥着重要作用。我们的研究强调了m6A甲基化机制在自噬中的功能的重要性。这些发现为FTO和m6A修饰调节自噬和脂肪生成的分子机制，以及预防和治疗肥胖的治疗策略的发展提供了深入的了解。