新发现：circTP63作为竞争性内源RNA通过上调FOXM1表达而促进肺鳞癌的发生

   非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的主要组织学类型，约占80-85%，其中肺鳞状细胞癌（LUSC）和肺腺癌（LUAD）是主要的亚型，最近，针对特定基因突变的靶向药物的开发极大地改善了晚期LUAD患者的治疗，，由于铂类化疗对LUSC的疗效降低所致，一小部分的LUSC港驱动基因突变，导致5年生存率低于5%。因此深入探索LUSC发生发展的分子机制，寻找治疗LUSC的潜在分子靶点变得尤为重要。近年来，circRNA作为一种新型的调控RNA分子，引起了广泛的关注，随着对其结构和功能深入认识，发现circRNA在人类疾病（动脉粥样硬化血管疾病、神经疾病、心脏病和癌症）等疾病中起重要作用。circRNA可作为竞争性内源RNA（ceRNA）在多种类型癌症中发挥功能，在肺癌中，LUAD相关的circRNAs被陆续发现，但是，尚未全面探讨circRNA在LUSC中的作用和机制。
    7月份，覃文新研究员课题组与姜丽岩教授团队合作发表一篇“circTP63 functions as a ceRNA to promote lung squamous cell carcinoma progression by upregulating FOXM1.”的SCI文章，IF= 11.878。该研究在五个LUSC病人标本中研究了circRNA和mRNA的表达谱，鉴定circTP63在LUSC中显著上调，进一步发现circTP63与LUSC病人的肿瘤大小和TNM分期呈正相关，而且体内外功能实验表明circRNA过表达促进LUSC细胞的周期进程和增殖。机制上，发现circRNA充当ceRNA来上调FOXM1来促进细胞增殖，竞争性结合miR-873-3p，进而破坏miR-873-3p对其靶基因FOXM1的抑制作用，从而FOXM1表达上调，进而促进其下游分子CENPA和CENPB的表达，最终影响细胞周期和增殖。简言之，该研究首次发现circTP63 通过ceRNA的机制驱动LUSC的发生发展，为LUSC的治疗提供了新策略。
技术路线：

一、筛选肺鳞癌关键环状RNA分子-circTP63
   通过q-PCR实验证实了circTP63在肺鳞癌组织中明显上调，而且circTP63的表达与TB63表达呈正相关。显然circTP63在LUSC中上调，重要的是， circTP63在LUSC组织与LUSC患者肿瘤较大小和更高的TNM分期呈正相关，并且其调节与以后的临床阶段相关。

二、肺鳞癌细胞中circTP63的鉴定
   circTP63来自TP63基因的外显子10至11，长度为295 nt。Northern印迹实验证明circTP63在295nt位置。circTP63转录本的半衰期超过24小时，比TP63更稳定（图  2d）。circTP63转录本偏好在细胞质中（图  2e）。在六个LUSC细胞系和两个人类正常肺细胞系中的内源性circTP63表达。我们发现circTP63在LUSC细胞系中上调相比于人正常肺细胞系（补充图  3a）。基于此结果，选择SW900和H1703细胞用于circTP63功能丧失检测，而选择H226和H2170细胞进行功能增益检测。这些结果进一步证实了circTP63作为circRNA 的特征。

三、体内外功能实验证明circTP63促进肿瘤细胞的增殖和生长。
   A和b. circTP63基因沉默后与过表达后qRT-PCR表明TP63的表达不受circTP63的影响；c和d. circTP63沉默或过表达后表明circTP63促进细胞增殖；e和f. circTP63沉默或过表达后表明促进细胞周期；g和h. circTP63沉默和过表达后表明circTP63增加肿瘤体积和重量。这些发现表明， circTP63可能在体外和体内在LUSC中发挥致癌作用。

四、circTP63在肺鳞癌中的分子机制。
   A和B.circTP63和mRNAs共表达网络图，发现了25个潜在的mRNA参与肺鳞癌的发展，其circTP63中FOXM1，KIFI8B和BRCA1是预测前三共表达的mRNA，而且在LUSC中FOXM1是明显上调8倍多。C.进一步确认了上调水平35个配对LUSC样品中的FOXM1的表达。D. 与KIF18B或BRCA1相比，circTP63的表达与FOXM1正相关.E. OXM1的八个成对LUSC样品的蛋白水平，然后用的转录水平的相关性的分析circTP63表明，FOXM1在LUSC组织显著上调并与正相关circTP63。F.通过qRT-PCR和Western blots验证了circTP63沉默明显降低FOXM1 mRNA和蛋白的表达水平，同时FOXM1沉默和过表达明显影响细胞的生长和细胞的周期发展，因此作者说明circTP63可能通过靶向FOXM1调控LUSC细胞的增殖。

五、circTP63调控FOXM1的表达。
   作者通过生信分析构建circTP63-miRNAs-FOXM1网络图，发现circTP63和FOXM1的共同结合位点。为了进一步证实circTP63可以作为ceRNA来调节FOXM1的表达，我们通过拷贝数测量了LUSC细胞系中circTP63和miR-873-3p的绝对表达水平。结果显示，在大多数测试的LUSC细胞系中，circTP63的绝对表达量远高于miR-873-3p（补充图  6d），这表明circTP63对海绵miR-873-3p是合理的。然后，我们使用生物素偶联的miR-873-3p模拟物进行了下拉实验，以检测circTP63和FOXM1的竞争结合活性到的miR-873-3p在H2170细胞。我们注意到，的近三倍富集circTP63和的近6倍富集FOXM1在的miR-873-3p捕获分数与阴性对照相比荧光酶实验分析表明miR-873-3p显著性降低circTP63的荧光活性表达，并且RIP也显示下拉的分子中富含大量的circTP63。利用RNA pull down验也发现circTP63和FOXM1复合物富集大量的miR-873-3p，过表达miR-873-3p同系物显著降低circTP63和FOXM1荧光素酶活性。circTP63充当ceRNA吸附miR-873-3p上调FOXM1的表达，影响肺鳞癌发展。

六、circTP63促进肺鳞癌细胞的周期发展。
   FOXM1是细胞周期调节器，控制细胞从G1期到S期以及到M期转变的过程。作者选择了FOXM1可能的8个下游靶基因，通过q-PCR检测到circTP63过表达时CENPA、CENPB和CCNB1显著性上调，回补实验和表型实验都证实了CENPA和CCNPB能够影响细胞的增殖。