抑制结直肠癌的进展——m6A是关键

   直肠癌是指从齿状线至直肠乙状结肠交界处之间的癌，是消化道最常见的恶性肿瘤之一。直肠癌位置低，容易被直肠指诊及乙状结肠镜诊断。但因其位置深入盆腔，解剖关系复杂，手术不易彻底，术后复发率高。YAP活化是结直肠癌(CRC)等肿瘤发生发展的关键因素。然而，目前尚不清楚N6-Methyl腺苷(m6A)是否修饰了lon的转录本。 G非编码RNA(LncRNAs)可调节YAP在肿瘤进展过程中的活化。2019年10月16日发表于 Mol. Cancer的一篇文章‘Long noncoding RNA GAS5 inhibits progression of colorectal cancer by interacting with and triggering YAP phosphorylation and degradation and is negatively regulated by the m6A reader YTHDF3’（影响因子： 10.679），主要研究了LncRNAs与m6A修饰在YAP信号传递和CRC进展中的功能联系。
结果:
一、与YAP相互作用的lncRNA的筛选和鉴定
   在八种不同的CRC细胞系中分析GAS5表达与CRC细胞中的YAP表达呈负相关。当GAS5被抑制时，核YAP蛋白会积累，而当GAS5过表达时，核YAP蛋白会下降。与YAP相互作用的lncRNA的候选物数量，并发现GAS5与YAP直接相互作用并抑制YAP的核积累。

二、GAS5与YAP蛋白相互作用的生化特征
   GAS5突变体Δ3与YAP结合的效率与全长GAS5一样有效，而其他突变体完全失去了其结合能力，表明与YAP结合需要GAS5的262-480位核苷酸。GAS5与YAP的171-263个氨基酸（aa）区结合（图2j）该区域编码称为WW域的结构域，图2k显示了YAP GAS5结合复合物的结构。利用两种独立的方法，包括生物层干涉法（BLI）分析，RNA荧光原位杂交（RNA FISH）和免疫荧光共染色测定法，以鉴定lncRNA GAS5与YAP之间的相互作用。进行了BLI分析，以检验YAP–GAS5复合物与Fortebio Octet系统的结合亲和力。生化映射表明，GAS5直接与YAP的WW域相互作用，以促进内源性YAP从细胞核到细胞质的转运。                                                                            

三、GAS5促进YAP磷酸化，以促进其泛素化和降解
   GAS5-/-降低了丝氨酸127处的YAP磷酸化水平，上调了YAP目标基因CTGF的表达。由于GAS5的上调显着抑制了YAP的总蛋白水平，而使YAP的mRNA水平保持不变，GAS5过表达细胞中多泛素化的YAP蛋白显着增加。与全长GAS5一样，GAS5突变体-Δ3的过度表达成功地促进了YAP磷酸化，而其他突变体则完全丧失了促进YAP磷酸化的能力（图3f）。在YAP抑制和GAS5上调组中，针对差异表达基因的KEGG通路分析的相交分析表明，共有543个共同目标高度重叠，主要在同一方向和丰富了Hippo途径，强烈支持GAS5在YAP信号传导中的关键作用（图3h-i）。GAS5通过促进YAP磷酸化和胞质螯合以促进其泛素化和降解来抑制YAP信号传导。

四、LncRNA GAS5通过体内外YAP失调抑制大肠癌进展
   为了研究GAS5在CRC进展中的作用在体外和体内，进行构建稳定地过表达GAS5或与YAP共转染的CRC细胞系。GAS5的过表达显着抑制了CRC细胞的增殖和侵袭能力，而增加的YAP表达成功逆转了GAS5介导的对CRC细胞增殖的抑制作用。体内实验显示GAS5的过度表达显着损害了肿瘤的生长，同时伴随着细胞活力和肿瘤体积的下降。说明GAS5通过在体外和体内抑制YAP信号传导来抑制CRC进展。

五、YTHDF3是YAP的新型靶标，可在体外和体内受GAS5调控
   由于YAP的失调对CRC的病理生物学和进展具有重要意义，因此进行RNA干扰介导的YAP敲除，以发现CRC肿瘤进展的潜在新靶标。 YAP的过表达增加了YTHDF3的表达以及CTGF和CYR61的表达。 CRC细胞中，YAP和YTHDF3之间的mRNA和蛋白表达呈正相关（图5g，h），YTHDF3是一个新颖的靶标YAP。YAP与YTHDF3的启动子结合，YAP共转染到CRC细胞中，YTHDF3启动子的荧光素酶活性大大增强，而YAP特异性siRNA显着抑制了荧光素酶活性（图5j）。

   功能获得和功能丧失分析表明，YTHDF3的敲低取消了YAP介导的CRC细胞增殖和侵袭的促进作用， GAS5的过表达抑制了YTHDF3和CTGF的表达，而YTHDF3的上调逆转了GAS5介导的YTHDF3和CTGF的抑制作用。功能测定表明，GAS5的上调显着抑制了CRC细胞的增殖和侵袭能力，而YTHDF3的共转染逆转了GAS5介导的CRC细胞增殖的抑制作用。肿瘤皮下生长和肺转移异种移植小鼠模型表明，YTHDF3的过表达导致肿瘤生长速率和肺部定植能力的显着加速，从而逆转了由GAS5过表达导致的肿瘤抑制（图6f和h）。表明YTHDF3是YAP的新靶标，而GAS5通过抑制YAPDF介导的YTHDF3在体内和体外的表达来抑制CRC细胞的增殖和侵袭。

六、YTHDF3结合m6A修饰的GAS5并促进GAS5的衰变
   由于在GAS5中积累了m6A修饰，YTHDF3敲低导致GAS5表达显着增加，表明YTHDF3在m6A介导的GAS5降解中起主要作用。YTHDF3选择性结合m6A修饰的GAS5并以甲基化依赖性方式调节GAS5降解，为CRC进展中GAS5失调提供了基础。

七、CRC患者肿瘤中LncRNA GAS5表达与YAP和YTHDF3蛋白水平呈负相关
   与邻近组织相比，CRC组织中GAS5的表达降低，而GAS5较低的表达与CRC患者肿瘤组织中YAP和YTHDF3的表达升高有关。后发现YTHDF3的高表达是CRC患者总体生存不良的重要预后因素，为CRC治疗提供了一种有希望的方法。

结论:
   lncRNAs和CRC中YAP信号的m6A修饰之间的功能联系。LncRNA GAS5直接与YAP结合，促进其磷酸化和泛素介导的降解，从而减弱YTHDF3的YAP介导转录，后者可逆、选择性地与m6A甲基化的GAS5结合，触发其衰变，形成负反馈环。该实验提出了lncRNA GAS5-YAP-YTHDF3轴在CRC进展中的负功能环，这可能为CRC的治疗提供一种有前景的方法。