METTL3介导的HDGF mRNA m6A修饰促进胃癌进展

   m6A甲基化被认为是真核mRNA中最丰富、最普遍的修饰。m6A修饰的作用包括调控mRNA的稳定性、剪切、转运、定位和翻译和RNA蛋白质交互。在过去的几年中，m6A调节因子的生物学功能被报道与干细胞分化、组织发育、昼夜节律周期和肿瘤进展相关。然而，m6A的生物学意义以及其在人类胃癌（GC）中的潜在调控机制仍不清楚。那么小编为大家介绍一篇最近发表在期刊Gut上的文章：“METTL3-mediated m6A modification of HDGF mRNA romotes gastric cancer progression and has rognostic significance”。在本研究中，我们揭示了METTL3介导的m6A修饰在GC中的生物学作用，并提出METTL3可能是一种新的预测GC进展的生物标志物和治疗靶点。

结果：
1.METTL3表达升高与胃癌患者预后不良相关
   为了阐明m6A修饰在胃癌中的功能作用，我们首先检测了28个胃癌组织和正常胃粘膜的m6A RNA水平。通过dot blot和ELISA检测，我们发现GC组织中的m6A RNA水平明显升高（图1A，1B）。其中甲基转移酶METTL3在GC中显著上调（图1C，1D）。另外，我们还发现，METTL3 mRNA水平升高的GC患者总体生存较差（图1E）。与上述结果一致，经western blot检测发现，86%人胃癌组织中METTL3蛋白水平明显高于正常胃组织（图1F）。这些结果在胃癌组织芯片中得到证实，经免疫组化染色显示，胃癌组织中METTL3的表达较正常胃组织明显增加（图1 G，H）。此外，METTL3表达增高的胃癌患者5年总生存期较差（图I）。多元回归分析表明，METTL3是一个独立的预测患者的预后的标志GC（图1 J）。为了进一步评估METTL3表达的预测能力，我们进行了时间依赖的接受者操作特征曲线分析，结果显示，临床风险评分(TNM期)和METTL3风险评分的联合作用远远大于单独的GC队列中的任何一个（图1K）。综上所述，m6A修饰和METTL3水平在GC中有所升高，METTL3可能是胃癌患者的独立预后因素。

2.p300介导的H3K27ac激活GC中METTL3的转录
   为了探索METTL3在GC中的高表达机制，我们首先通过UCSC基因组生物信息学位点分析了METTL3启动子的修饰。如图2A所示，在METTL3的启动子区发现大量的H3K27乙酰化（H3K27ac）信号，提示METTL3可能受染色质乙酰化调控。然后，我们用靶向P300的组蛋白乙酰转移酶抑制剂C646处理HGC-27细胞，结果显示METTL3表达明显下降，呈时间和剂量依赖性，HGC-27细胞未表现出明显的细胞毒性（图2B-D）。使用western blot检测，我们发现C646处理后H3K27ac和METTL3蛋白水平下降（图2E）。接下来，我们使用特定的siRNAs敲除P300（图2F），发现P300的敲除显著降低了METTL3的mRNA和蛋白水平（图2G，H）。此外，染色质免疫沉淀实验结果表明，METTL3的启动子区域在P300结合和H3K27ac信号中富集，P300的敲除可以显著降低METTL3启动子中H3K27ac信号的富集（图2I，J）。这些数据证实，p300介导的METTL3启动子H3K27ac活化可能是METTL3上调的部分原因（图2K）。

3.METTL3促进GC增殖和血管生成
   为了研究METTL3在GC中的作用，我们建立了稳定的过表达METTL3的GC细胞（图3A）。METTL3的上调显著提高了GC细胞软琼脂菌落形成效率(图3B)和克隆能力（图3C）。我们还检测METTL3提升GC细胞增殖是否依赖于其m6A催化活性。与野生型细胞相比，催化突变的METTL3能显著降低BGC823细胞的m6A水平（图3D）。此外，METTL3的m6A催化活性对于促进BGC823细胞的克隆能力是必不可少的（图3E）。我们还建立了稳定的METTL3敲除的GC细胞。在METTL3敲除或敲除后，m6A水平显著降低（图3F）。敲除METTL3明显抑制软琼脂菌落形成效率和克隆能力（图3G，H）。另外，过表达METTL3大大促进肿瘤生长（图3 I-K）。IHC结果显示与对照相比，METTL3过表达组的肿瘤组织增加（图3L）。为了进一步研究METTL3在胃癌血管生成中的作用，我们在体外研究了人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的生长和成管过程。过表达METTL3的BGC823细胞的条件培养基显著增加了管的形成和HUVEC生长（图3M）。我们还建立了3例不同类型的胃癌患者的器官样体模型，进一步验证METTL3的潜在临床价值。结果表明，慢病毒过表达METTL3可显著促进三种不同类型GC器官中GC细胞的增殖（图3N）。这些数据表明，METTL3可能是一种致癌基因，其m6A催化活性可促进胃癌的增殖和血管生成。

4.METTL3促进胃癌的体内外转移
   为了确定METTL3在胃癌转移中的作用，我们首先在体外进行了迁移和侵袭实验。数据显示METTL3的异位表达促进了BGC823和AGS细胞的迁移和侵袭（图4A，B）。然而，在HGC-27和NCI-N87细胞中，METTL3敲除产生相反的作用（图4C）。我们进一步评估了METTL3对胃癌体内转移的影响。通过裸小鼠脾静脉注射过表达METTL3的BGC823 -荧光素酶细胞及相应的对照细胞。8周后，METTL3的上调明显促进了GC肝转移，生物荧光成像显示，与对照组相比，METTL3的上调明显促进了GC肝转移（图4D-F）。相比之下，METTL3缺乏的NCI-N87细胞显著抑制了GC肝转移（图4G，H）。总之，这些结果表明METTL3在促进胃癌转移中的关键作用。

5.METTL3介导的HDGF mRNA m6A修饰维持了其依赖IGF2BP3的稳定性
   为了明确METTL3促进胃癌进展的分子机制，我们对METTL3过表达和敲除的GC细胞进行RNA测序，并对METTL3过表达的GC细胞和对照细胞进行m6A修饰的RNA免疫沉淀测序（图5A）。通过分析和细胞实验确定了HDGF mRNA m6A修饰（图5B-G）。METTL3过表达的免疫纯化RNA中AGACC motif高度富集（图5H）， METTL3上调时HDGF mRNA中的m6A丰度显著增加（图5I）。另外，m6A特异性抗体显著富集了METTL3过表达的HDGF mRNA，而m6A特异性抗体显著降低METTL3敲除对HDGF mRNA的富集（图5J）。考虑到m6A修饰对HDGF的mRNA水平具有正向调节作用，我们进而研究m6A修饰是否影响HDGF mRNA的稳定性。结果表明，METTL3过表达时HDGF mRNA水平高度稳定，敲除METTL3则相反（图5K）。此外，据报道HDGF是IGF2BP1/2/3的高通量测序结果的靶标之一。因此，我们探讨了IGF2BP1/2/3对HDGF mRNA稳定的影响。其中只有IGF2BP3的下调显著抑制HDGF mRNA的表达（图5L）。与IgG对照抗体相比，IGF2BP3特异性抗体在RIP-qPCR检测中显著富集HDGF mRNA（图5K）。接下来，我们比较了28个GC组织和TCGA数据中HDGF和IGF2BP3的mRNA水平。结果显示，与正常胃组织相比，胃癌组织中HDGF和IGF2BP3的表达显著上调（图5N-Q）。我们还发现METTL3和IGF2BP3的表达与HDGF的表达显著相关（图5R，S）。我们也进行肿瘤异种移植研究。结果表明，敲低METTL3、HDGF和IGF2BP3可显著抑制肿瘤生长（图5T-V）。

6.METTL3通过上调HDGF表达来加速GC恶性过程
   为了进一步表征HDGF在GC中的致癌功能，我们设计了三种不同的针对HDGF的siRNAs，并通过qRT-PCR和western blotting证实了它们的敲除效率（图6A）。HDGF的下调显著抑制了菌落形成、细胞迁移和侵袭以及HUVEC的生长和成管（图6B-D）。此外，HDGF重组蛋白挽救了METTL3敲除GC细胞的集落形成能力（图6E）。与预期一样，在METTL3过表达的AGS细胞中，HDGF的表达被其特异性的siRNAs敲除，从而显著抑制了METTL3诱导的GC细胞迁移和侵袭（图6F）。此外，HDGF的敲低明显抑制METTL3诱导的 GC体内生长和血管生成（图6G-J）。因此，我们的数据表明，METTL3通过上调HDGF表达来促进GC恶性进展。

7.METTL3通过HDGF激活的GLUT4和ENO2的表达来促进GC中的糖酵解
   我们研究METTL3是否调节糖酵解促进GC恶性过程。如图7A，B所示，上调BGC823细胞中METTL3的表达可显著增加葡萄糖摄取和乳酸的产生。为了研究HDGF是否能恢复METTL3敲除细胞的糖酵解活性，我们将HDGF过表达质粒转染到METTL3敲除细胞中。结果表明HDGF过表达可恢复METTL3敲除GC细胞的糖酵解活性，并显著增加乳酸产量（图7C）。细胞外酸化速率动力学曲线进一步表明，过表达METTL3的BGC823细胞的糖酵解活性显著增加，而敲除METTL3的HGC-27细胞的糖酵解活性下降（图7D，E）。为了进一步研究METTL3调控糖酵解的机制，我们检测了METTL3过表达和METTL3敲除的GC细胞中与葡萄糖代谢相关的基因的转录（图7F）。我们还检测了这些基因是否受HDGF调控，并检测了HDGF敲低GC细胞中与葡萄糖代谢相关的基因（图7G）。发现只有GLUT4和ENO2的表达水平主要通过上调METTL3而增强。考虑到HDGF可以在细胞核中定位并发挥转录调控作用，我们研究了HDGF是否可以转录激活GLUT4和ENO2的表达。通过ChIP分析发现，HDGF直接与GLUT4和ENO2的启动子区结合，而与HK2的启动子区不结合（图7H）。IHC结果显示，METTL3过表达导致AGS肿瘤异种移植中HDGF、GLUT4和ENO2染色明显增加，而当HDGF敲除时，GLUT4和ENO2表达明显下降（图7I）。同样，在缺乏METTL3的NCI-N87肿瘤异种移植中，HDGF、GLUT4和ENO2染色明显下降（图7J）。总之，这些结果表明METTL3/HDGF通过糖酵解途径促进胃癌的发生和肝转移。
   为了研究METTL3 / GC HDGF轴在促进糖酵解和血管生成中的临床意义，我们检查METTL3，HDGF，GLUT4，ENO2和CD31在GC患者癌组织中的表达。54例胃癌患者中METTL3表达与HDGF、CD31、GLUT4、ENO2表达呈正相关（图8A，B）。

结论：
   我们的发现揭示了METTL3在胃癌发生发展中的致癌作用。机制上，METTL3/ HDGF/GLUT4/ENO2轴通过增加糖酵解和血管生成来促进胃癌的发生和转移。另外，METTL3在胃癌中的表达明显增加，与胃癌患者预后不良有关。因此，METTL3可能是胃癌潜在的预测和治疗靶点。