LncRNA LINRIS-结直肠癌的预后生物标志物

   结肠癌（CRC）是一种侵袭性的原发性肠恶性肿瘤，在全球所有类型的癌症中，其发病率均排在第三位，而其死亡率则位居第二。 因此，寻找新的CRC治疗策略具有重要意义。长链非编码RNA（lncRNA）在癌细胞的表观遗传调控中起着不可忽略的作用。小编为大家带来最新发表于Molecular Cancer上的文章：“LncRNA LINRIS stabilizes IGF2BP2 and promotes the aerobic glycolysis in colorectal cancer”。这项研究旨在确定一种特定的lncRNA，该基因可促进结直肠癌（CRC）的进展，并可能成为潜在的治疗靶标。我们在人类CRC样本中筛选了高表达的lncRNA，并将其与匹配的邻近正常组织进行比较。RNA下拉和RNA免疫沉淀（RIP）分析证实了与LINRIS相互作用的蛋白质。在体外和体内测试了被LINRIS抑制的CRC细胞的增殖和代谢改变。

结果：
1.LINRIS在CRC中高表达，预后差
   为了探索可能影响CRC进展的lincRNAs，我们将CRC期患者的肿瘤组织与配对的邻近正常组织进行RNA-seq转录组比较。基于RNA-seq分析，我筛选出7个高表达lncRNA，包括LINC00920（更名为LINRIS）（图1a）。我们发现LINRIS的高表达与CRC患者的不良总生存相关（图1b，c）。根据TCGA数据库，与正常细胞中的表达相比，大多数类型的肿瘤和CRC细胞系中LINRIS的表达上调（图1d和图1e），这些结果表明LINRIS通常起致癌基因的作用。食管鳞状细胞癌（ESCC），胃癌（GC）和胰腺导管腺癌（PDAC）的患者样本中也显示了LINRIS在消化道癌症中的致癌状态（图1f）。接下来，我们用shRNA敲除CRC细胞中的LINRIS。 使用BrdU和3D培养法比较了用LINRIS特异性shRNA（sh-1和sh-2）转染的CRC细胞与阴性对照（sh-NC），结果确定了LINRIS的促癌作用（图1g-i）。 通过RNA FISH分析，我们发现LINRIS主要位于细胞质中（图1j-l）。

2.LINRIS与IGF2BP2相互作用并维持其表达
   为了确定LINRIS诱导CRC细胞进程的分子机制，我们进行了RNA下拉测定和质谱分析，以探索可能与LINRIS相关的蛋白质。我们确定IGF2BP2作为我们的第一个靶标。如图2a-d所示，LINRIS可以直接结合到IGF2BP2。为了定位靶向IGF2BP2的LINRIS的结合位点，我们首先构建了两个截短的LINRIS载体并进行了RNA下拉测定，因为该lncRNA的长度仅为913 bp。但是，LINRIS的N端（1–570 nt）和C端（571–913 nt）片段都不能与IGF2BP2紧密结合（图2e）。因此，根据其二级结构，我们构建了另一个带有LINRIS 450-640 nt片段的载体。 RNA下拉分析表明该中间区域（450-640 nt）负责LINRIS和IGF2BP2之间的结合。
   通过测量LINRIS和IGF2BP2在人CRC细胞系中的表达，我们发现它们之间呈正相关（图2f，g）。 HCT116和DLD-1细胞中的LINRIS敲低均显著下调了IGF2BP2的表达（图2h）。 此外，敲除LINRIS会显著增加IGF2BP2的泛素化，但会抑制IGF2BP2调节的mRNA（图2i）。 因此，我们认为IGF2BP2可能是LINRIS分子机制的关键，并且该lncRNA可能阻止了IGF2BP2的降解。

3.LINRIS保护IGF2BP2不被自噬降解
   IGF2BP2由2个RNA识别基序（RRM）和4 K同源性（KH）域组成，我们建立了3个带有FLAG标签的载体，其中包含IGF2BP2的片段在非活性区彼此重叠（图3a）。 RIP分析表明LINRIS主要结合到RRM区域（图3b）。 然后，我们从CPLM数据库中获得了实验确定的IGF2BP2泛素化位点。 如图3c所示，与野生型（WT）相比，代替K77R的K139R泛素突变显著损害了IGF2BP2的泛素化。 此外，该突变还消除了RNA下拉测定法中LINRIS和IGF2BP2之间的结合（图3d），表明LINRIS通过掩盖K139抑制了IGF2BP2的泛素化。
   为了阐明IGF2BP的降解模式，用蛋白合成抑制剂CHX处理LINRIS表达下调的CRC细胞，其IGF2BP2半衰期比未处理的对照细胞要短（图3e）。然而，在sh-LINRIS转染的细胞中，当用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞时，内源性IGF2BP2表达不会增加（图3f），这表明IGF2BP2的降解可能与比泛素-蛋白酶体途径更复杂的机制有关。
   除了泛素-蛋白酶体系统（UBS），细胞蛋白在泛素化后可从自噬-溶酶体途径（ALP）降解（图3g）。如图3h所示，内吞IGF2BP2蛋白的减少被自噬抑制剂bafilomycin A1（Baf A1），NH4Cl和3-甲基腺嘌呤（3-MA）成功逆转。相反，自噬激活剂Earle的平衡盐溶液（EBSS）和雷帕霉素（Rap）降低了IGF2BP2的水平（图3i）。 EBSS处理的细胞还表现出IGF2BP2和LC3B的共定位增加（图3j）。综上所述，提示LINRIS介导的IGF2BP2降解是通过泛素化自噬途径实现的。

4.LINRIS与IGF2BP2相互作用影响MYC介导的糖酵解
   由于MYC的mRNA被IGF2BP2识别为其众所周知的下游靶点，我们研究了LINRIS与IGF2BP2相互作用时糖酵解的变化。如图4a、b所示，LINRIS被敲除后，其介导糖酵解的下游基因GLUT-1、PKM2、LDHA也表现出与MYC一致的水平下降。此外，MYC、GLUT-1、PKM2和LDHA的mRNA水平与CRC组织中的LINRIS水平呈正相关（图4c）。如图4d和e所示，沉默LINRIS可导致HCT116和DLD-1细胞糖酵解的减弱。图4f显示LINRIS基因敲除降低了一些典型的糖酵解产物。综上所述，LINRIS对于维持癌细胞的糖酵解是必要的，糖酵解可能影响CRC的增殖。此外，我们用过表达IGF2BP2的质粒转染了CRC细胞。 如图4g-i所示，在HCT116和DLD-1细胞中，在某种程度上挽救了由LINRIS敲除诱导的增殖和糖酵解受损。

5.LINRIS的抑制抑制了体内CRC的生长
   为了研究低LINRIS表达是否会抑制体内CRC肿瘤的生长，我们向BALB/c裸鼠的盲肠注射了具有或不具有LINRIS敲低的HCT116细胞（sh-NC，sh-1和sh-2）。 与具有sh-1或sh-2的细胞相比，HCT116/sh-NC细胞在4周内形成了更大，更重的原位肿瘤（图5a和b）。此外，我们用异种移植（PDX）模型测试了抗LINRIS治疗的体内作用。如图5c，d所示，通过RNAi抑制LINRIS可显着抑制肿瘤的生长。切除的肿瘤切片的IHC染色显示，随着LINRIS的耗竭，与IGF2BP2和MYC一致的Ki-67表达降低（图5e和f）。总体而言，阻塞LINRIS-IGF2BP2-MYC轴是有希望的CRC治疗方法。

6.GATA3抑制LINRIS的转录活性
   为了研究调控LINRIS转录的因素，我们使用JASPAR数据库预测了潜在的转录因子，并发现GATA3具有与LINRIS启动子结合的最大可能性（图6a）。使用Oncomine数据库分析了来自多个实验的CRC微阵列数据，该数据表明GATA3在CRC组织中的表达水平低于正常组织（图6b）。此外，根据TCGA数据库，更高的GATA3表达与CRC患者的更好预后相关（图6c）。抑制GATA3成功地解放了LINRIS的转录（图6d）。 ChIP-PCR分析显示LINRIS启动子区域被GATA3占据（图6e），荧光素酶启动子分析显示GATA3过表达抑制LINRIS活性，反之亦然（图6f，g）。此外，LINRIS启动子中GATA3结合位点的突变消除了这种转录调控（图6h）。通过分析中山大学癌症中心的人类CRC样本中LINRIS和GATA3的mRNA表达，我们还观察到它们之间呈负相关（图6i）。我们还通过RNA ISH分析测量了LINRIS的表达，并通过IHC分析测量了GATA3的表达（图6j）。如图6k所示，增加的LINRIS表达更可能伴随着GATA3表达的降低，反之亦然。总之，GATA3抑制了LINRIS的转录。

7.LINRIS-IGF2BP2-MYC轴与CRC的发生发展密切相关
   为了进一步说明LINRIS-IGF2BP2-MYC轴在CRC发育中的临床和病理学意义，我们分析LINRIS、Ki-67，IGF2BP2，MYC，GLUT-1，PKM2和LDHA的表达（图7a）。如图7b所示，高LINRIS组与Ki-67，IGF2BP2，MYC，GLUT-1，PKM2和LDHA的高表达相一致，而低LINRIS组表现出相反的结果。此外，与正常组织相比，这些患者的肿瘤组织中的IGF2BP2表达明显更高（图7c，d）。 IGF2BP2的较高表达也与CRC患者的预后不良有关（图7e）。高LINRIS / IGF2BP2组的预后较其他两组差（图7f）。综上所述，LINRIS-IGF2BP2-MYC轴深刻影响了CRC的发展和预后，并成为潜在的治疗靶点。

结论：
   我们在CRC中发现了一种名为LINRIS的高表达lncRNA。LINRIS通过泛素化-自噬途径阻断IGF2BP2的降解。因此，MYC介导的糖酵解被下调，抑制了体内外CRC细胞的增殖。LINRIS-IGF2BP2-MYC轴促进CRC的进展。LINRIS是一种独立的CRC预后生物标志物。