lncRNA LCAT1通过海绵吸附miR-4715-5p调节RAC1的表达促进肺癌进展

   lncRNA逐渐成为癌症发展和进程中的关键角色。 然而，大多数lncRNA在肺癌发生中的生物学作用和临床意义仍不清楚。在这项研究中，作者确定并探索了新的lncRNA，即肺癌相关转录本1（LCAT1）在肺癌中的促进作用。本文于2019年11月发表在Molecular Cancer（IF：10.679）杂志上。
主要结果如下：
1、LCAT1在肺癌中上调，与预后不良有关
   如图1所示，lncRNA LCAT1在在正常组织中低表达，在肺癌中高表达，并与肺癌不良预后相关。

2、LCAT1沉默抑制肺癌细胞的体内外增殖
   如图2所示，沉默LCAT1表达后，肺癌细胞的体外增殖和体内成瘤能力都下降了。

3、LCAT1敲除可降低肺癌细胞的转移，并诱导细胞G1期阻滞
   如a-e所示，敲除LCAT1后，肺癌细胞的转移和迁移能力明显下降。图3f所示，转染LCAT1特异性干扰片段后，细胞的G1期受到抑制。为了探究LCAT1涉及到的分子和通路，敲低LCAT1后进行了转录组测序，图3g是差异表达基因热图，主要的靶向途径包括细胞周期和粘附连接（图3h）。

4、LCAT1在肺癌细胞中起ceRNA作用海绵吸附miR-4715-5p
   亚细胞定位显示LCAT1主要定位于细胞质(图4a和b)。RIP实验显示，LCAT1与Ago2结合，Ago2是RNA诱导沉默复合物的主要成分，参与miRNA介导mRNA抑制(图4c)。这提示，LCAT1可能作为ceRNA作用于miRNA发挥功能。为了验证这个猜测，首先预测LCAT1与miRNA之间的作用位点，如图4d所示。预测的4种miRNA种，只有miR-330-5p和miR-4715-5p才能抑制LCAT1驱动的荧光素酶活性，而miR-4715-5p的抑制作用强于miR-330-5p(图4 e)。进一步的验证LCAT1与miR-4715-5p的作用关系(图4 f)，如图4g 所示，敲除LCAT1显著增加了miR-4715-5p的表达。

5、LCAT1的功能部分是通过抑制miR-4715-5p表达介导的
   如图5a-d所示，过表达miR-4715-5p可以显著降低肺癌细胞的增殖，迁移，侵袭和集落形成。过表达miR-4715-5p可在Calu1、A549和HOP62细胞系中诱导G1-G0期的细胞周期阻滞(图5e-h)。为了研究miR-4715-5p是否介导LCAT1在肺癌细胞中的功能，将si- LCAT1与miR-4715-5p抑制剂共转染至肺癌细胞，结果显示miR-4715-5p抑制剂可以部分挽救si- LCAT1介导的细胞增殖抑制（图5i-j）。

6、RAC1是miR-4715-5p的靶基因，由LCAT1间接调控
   靶基因预测并结合转录组测序发现，RAC1是敲除LCAT1后变化最显著的靶基因之一，并且属于Ras信号通路（图6a）。突变RAC1与miR-4715-5p的结合位点之后，荧光素酶信号显著下降（图6b）。过表达miR-4715-5p的细胞中RAC1 mRNA和蛋白水平均显著下调（图6 c和d）。由于LCAT1可以海绵吸附miR-4715-5p，因此接下来验证LCAT1是否通过与miR-4715-5p的竞争性结合影响RAC1的表达。结果显示，LCAT1下调显著降低了Calu1和A549细胞中RAC1 mRNA和蛋白水平 (图6e和f)。TCGA数据显示，RAC1在肺癌组织中显著上调(图6g)，并且RAC1高表达与肺癌患者预后不良显著相关(图6h和i)。此外肺癌患者RAC1拷贝数正常或低时往往具有较高的LCAT1表达，从而可能会驱动RAC1的表达(图6j)。

7、LCAT1通过海绵吸附miR-4715-5p调控RAC1 / PAK1的表达促进肺癌细胞增殖和进展
   敲低RAC1后细胞的集落形成和增殖均显著下降（图7a和b），同时诱导G1-G0期细胞阻滞（图7c和d）。此外，WB实验发现抑制RAC1限制抑制了PAK1蛋白磷酸化（图7e）。类似的，在miR-4715-5p过表达和LCAT1敲低的肺癌细胞中， PAK1的磷酸化和表达水平均下调(图7f和g)。

8、RAC1抑制剂与紫杉醇联合治疗肺癌
   基于以上结果，作者推测是否可以通过药物抑制RAC1活性来达到治疗肺癌的结果。EHop-016是一种新型的RAC GTPase小分子抑制剂，图8a所示，EHop-016能抑制肺癌细胞增殖，且其在三种细胞系中的用量有所不同（图8b）。因此作者检测了EHop-016对RAC1活性的影响，结果显示，EHop-016可降低RAC1-GTP的表达(图8c)，而LCAT1敲除则使细胞对EHop-016失去敏感性(图8 d)。紫杉醇是一种广泛用于治疗包括肺癌在内的多种恶性肿瘤的化疗药物。因此作者探究了其体外联合治疗的效果。结果显示，EHop-016与紫杉醇联合治疗可使细胞生长速度降低60-70%，对细胞活力的影响明显增大(P < 0.05)。与EHop-016、紫杉醇单药组比较，差异有统计学意义（图8f）。

   作者提出的机制路线图如图8g所示，lncRNA LCAT1通过海绵吸附miR-4715-5p，从而调控RAC1 / PAK1的表达，最终促进肺癌细胞增殖和进展。
参考文献：
   Yang Juze., Qiu Qiongzi., Qian Xinyi., Yi Jiani., Jiao Yiling., Yu Mengqian., Li Xufan., Li Jia., Mi Chunyi., Zhang Jisong., Lu Bingjian., Chen Enguo., Liu Pengyuan., Lu Yan., (2019). Long noncoding RNA LCAT1 functions as a ceRNA to regulate RAC1 function by sponging miR-4715-5p in lung cancer., Mol. Cancer, 18, 171.