突破研究局限-----血浆胞外小泡microRNAs检测肺癌

导语：
   肺癌具有潜在的恶性和异质性特点，尤其难以诊断, 因此，需要开发无创的肺部毛玻璃样结节GGNs诊断方法和风险层理方法。血浆胞外囊泡(EVs)来源的miRNA对孤立性肺结节(SPNs)，尤其对毛玻璃结节(GGNs)的临床诊断和分子特征提供了可行性思路。然而，回顾性研究固有的选择性偏见和不太严格的识别方法对研究有存有一些局限性。 因此，有待对照研究比较恶性孤立性肺结节(SPNs)与良性疾病之间的差异。
技术路线：
1.收集病人血浆样本，并分离血清
2.分离血浆EV，纳米颗粒跟踪分析(NTA)EVs的数目大小，EVs表征等
3.扫描电镜(SEM)扫描电镜分析，然后从血浆EVs中分离RNA。
4.小RNA文库的制备和测序
5.miRNA-seq数据的生物信息学分析。
6.EVs miRNA在三个恶性结节亚群中的表达特点
7.恶性结节分层的生物学分析。
8.术前和术后血浆样本miRNA谱的比较
研究结果：
1.患者及临床病理资料
   共纳入99例患者，其中良性结节20例(20.2%)。其他样本被诊断为腺癌，范围从原位腺癌(AIS)到侵袭性腺癌。79例恶性肿瘤标本中16例为pGGNs, 21例为mGGNs, 42例为实性结节，其中20例为术后血浆标本。

2.Evs表征
   使用Western blotting评估了7个代表性EV样本中的几个囊泡标记，包括Alix、TSG101、Syntenin、CD9和Calnexin。此外，为了表征等离子体中电动汽车的浓度和尺寸，使用了Nanosight NS300系统进行纳米颗粒跟踪分析。结果表明，分离出的囊泡大部分在100 nm左右，这是典型的外泌体大小。另外，两个典型EV样品的SEM图像如下图所示。

3.归一化、稳定化和组合来构造SVM分类器
   使用映射率大于90%的样本，设置了5个映射和表达的读取作为截止点。将其作为两个miRNAs的比值进行分析，其中一个miRNA被认为是靶基因，其他miRNA被认为是参考基因。使用两对miRNA的比值来构建一个二维空间，SVM可以用来确定区分良恶性结节的最佳cut-off。miR - 185 - 5 - p / miR-32-5p和miR - 140 - 3 - p / let-7f-5p SVM模型显示诊断价值最高,敏感性和特异性的85.1%和75%,分别在参照集和59.3%和100%,分别在验证集。此外, miRNA的结合灵敏度最高的miR-27a-5p / miR - 550 - 5 - p和miR - 1908 - 5 - p / miR - 98 - 5 - p。该组合在训练集和验证集的敏感性分别为100%和96.9%。此外，特异性最高的miRNA组合为miR-185-5p/miR-378i和miR-495-3p/miR-99b-3p。这种组合在参照集和验证集的特异性都是100%。

4. EVs miRNA在三个恶性结节亚群中的表达特点
   为了进一步评估血液EVs miRNA表达谱的潜在分类价值，术前对所有来自恶性结节患者的样本进行PCA分析。pGGN样品与固体样品的分布比较明显。pGGN样品主要集中在中心区域，而固体样品分为两组。有趣的是，表皮生长因子受体基因19外显子小缺失的12个实性结节中有11个被归为1类;这明显高于第二组。mGGN样品也可以与固体样品归为同一类。这些结果揭示了血液EVs miRNAs中恶性结节的复杂性。

5. 恶性结节分层的生物学分析
   选择绝对权重大于0.05的1组和2组差异表达的miRNA。通路富集分析显示，这些miRNA主要针对癌症相关通路，如细胞周期和粘附连接。有趣的是，miR-500a-3p、miR-501- 3p和miR-502-3p三种不同的阳性表达的miRNA对肺腺癌患者在肿瘤组织中的生存具有很强的危险比。相反，负权数高的miRNA并没有显示出显著的危险比。miR-500a-3p、miR-501-3p和miR-502-3p位于CLCN5内含子的近端，可能是协同调控的。与第二组相比，第一组这三种miRNA均上调，p值显著(p < 0.001, p < 0.001, p < 0.001);。有趣的是，TCGA中这三种miRNAs在肿瘤组织中的上调与这些miRNAs下调后肿瘤组织中观察到的更好的总体生存相关。总的来说，1组实性结节血液EVs中这3种miRNA的上调与患者预后的改善有关。

 

6. 术前和术后血浆样本miRNA谱的比较
   通过比较术前和术后血液EVs的miRNA表达谱，发现9种miRNA在术前和术后有显著的差异表达。在这些miRNA中，miR-320b和miR- 128-3p在1组和2组实性结节中也有差异表达。miR-320b在与细胞增殖相关的Hippo信号通路中富集。然而，miR-128-3p的靶点没有富集通路。这些数据表明，1组和2组实性结节可能来自不同的致癌途径。此外，miR-500a-3p、miR-501-3p、miR-502-3p在术后均有上调，其边缘p值分别为(p = 0.058、p = 0.011、p = 0.020)，提示miR-500a-3p、miR-501-3p、miR-502-3p的常表达可能与肿瘤进展相关。

总结： 
   评估了血浆胞外囊泡(EVs)来源的miRNA对孤立性肺结节(SPNs)，尤其是毛玻璃结节(GGNs)的诊断价值和分子特征。对59例患者(包括12例良性结节患者)的血浆EVs miRNA进行小RNA测序(2017，参照集)。对另外40个个体的MiRNA谱进行了测序(2018年，验证集)。总的来说，包括16例单纯ggn、21例混合ggn和42例实性结节，20例患者术后可获得配对的血浆样本。利用靶miRNA/参考miRNA比值构建支持向量机(SVM)模型。特异性最好的SVM模型在参照集和验证集的特异性分别为100%。灵敏度最好的模型在训练集和验证集的灵敏度分别为100%和96.9%。主成分分析显示，纯GGN分布与实性结节不同，混合GGN呈弥散分布。在差异表达的miRNA中，miR-500a-3p、miR-501-3p和miR-502-3p在肿瘤组织中表达上调，总体生存期提高。SVM分类器能准确区分恶性ggn和良性结节。其独特的轮廓特征为EVs miRNA作为肺癌预后因子的可行性提供了思路。
   总之，提供了一种稳定且有价值的基于血浆EVsderived miRNAs的SVM分类器模型，用于区分恶性GGNs和良性结节(最高特异性为100%;最高灵敏度:98.9%)。此外，还发现了纯GGNs、混合GGNs和固体样品中miRNA表达谱的明显特征。我们认为开发一种有效的、无创的诊断和风险分层模型对临床医生有帮助。