神经母细胞瘤的有效疗法——靶向抑制circ-CUX1

   好氧糖酵解是肿瘤进展中代谢重编程的一个标志。然而，调节糖酵解基因表达的机制在儿童最常见的颅外恶性肿瘤神经母细胞瘤（NB）中仍不清楚。从此研究背景出发，本文作者发现CUT-like homeobox 1 (CUX1) 和CUX1-generated circular (circ-CUX1)有助于有氧糖酵解和NB的进展。而阻断circ-CUX1级联可以有效抑制NB的体内体外进展。本文于2019年12月新近发表在EMBO Mol Med (IF: 10.624)期刊上。
结果如下：
1、CUX1促进好氧糖酵解和肿瘤进展
   对88例NB患者的微阵列数据进行综合分析获得了8个差异表达的糖酵解基因，并发现了52个与NB临床表现相关的转录因子，这52个转录因子与这8个糖酵解基因的转录因子存在重叠，其中CUX1是潜在靶点数量最多的转录因子（Fig 1A）。异位表达CUX1可以相应的增减或减少糖酵解相关基因的表达，如ENO1、GP1和PGK1，其他基因的表达则不受影响（Fig 1B-E）。过表达p110 CUX1增加了细胞的胞外酸化率(ECAR)，降低了细胞的耗氧率(OCR)，而CUX1敲低或E64D处理显著减弱了糖酵解过程(图1F和G)。以上结果说明CUX1是一种促进好氧糖酵解和肿瘤进展的转录因子。

2、Circ-CUX1在NB组织和细胞系中表达上调
   如图2所示，circ-CUX1是由CUX1的外显子2和部分内含子2组成的393-nt环状CUX1，定位于细胞核，并在NB和其细胞系中均高表达。此后，作者经实验证实circ-CUX1在转录水平上增强CUX1的表达。

3、Circ-CUX1在肿瘤进展中发挥致癌作用
   如图3所示，过表达circ-CUX1促进了体外肿瘤细胞的集落形成、迁移和侵袭，促进体内肿瘤的生长，肺部转移以及肿瘤Ki-67和CD31表达、葡萄糖摄取、乳酸产生、ATP水平。这些结果表明circ-CUX1在肿瘤的发生和侵袭性中发挥着致癌作用。

4、Circ-CUX1与NB细胞中的EWSR1蛋白直接相互作用
   图4A是作者寻找circ-CUX1相互作用蛋白的方法示意图，据此找到3个潜在蛋白：EWSR1，ELAVL1和SYNCRIP。pull-down实验在未转染的细胞中只能检测到内源性和外源性circ-CUX1，以及EWSR1与circ-CUX1复合物，而另外两个蛋白或者相互作用均未能检测到（Fig 4B）。
   进一步证实circ-CUX1和EWSR1存在相互作用及共定位（Fig 4C-D），以及RNA电泳迁移率检测和GST标记证实EWSR1蛋白与circ-CUX1相互作用，且是与的RNA识别基序(RRM)域而不是与p200 CUX1或CASP转录本相互作用（Fig 4E-F）。以上结果表明circ-CUX1与EWSR1蛋白在NB细胞直接相互作用。

5、Circ-CUX1促进了EWSR1介导的MAZ活化
   为进一步研究circ-CUX1的靶基因，作者进行了RNA-seq，发现过表达circ-CUX1后，IMR32细胞中有781个上调基因和434个下调基因（Fig 5A）。从中筛选到5个差异显著的转录因子，然后从BioGRID数据库中提取的与EWSR1相互作用的蛋白做进一步的重叠分析，发现MAZ蛋白是参与这一过程的唯一转录因子（Fig 5B）。此外，标记MAZ的锌指结构域与EWSR1的相互作用是必需的，但不是N端或C端。实验发现，circ-CUX1的过表达或敲除相应增加或减少了IMR32和SH-SY5Y细胞中EWSR1和MAZ的相互作用(Fig 5C和D)。
   在IMR32和SH-SY5Y细胞中，circ-CUX1的过表达或敲除相应增强和减少了MAZ与这5个靶基因启动子的结合，而当EWSR1的沉默或过表达则可以消除这些作用（Fig 5E）。荧光素酶实验显示野生型CUX1，MAZ结合位点的启动子活性受circ- CUX1异位表达或敲低的影响而升高或降低，而突变型则不受影响（Fig 5F）。此外，稳定转染circ-CUX1或shcirc-CUX1＃1的IMR32和SH-SY5Y细胞中CUX1，S100A9，MUC4，KLF10或TXNIP的水平发生了显着变化（Fig 5G和H）。敲除或过表达EWSR1或MAZ可挽救肿瘤细胞的这些变化（Fig 5F-H）。这些数据表明，circ-CUX1促进了NB细胞中EWSR1介导的MAZ反式激活和靶基因的转录改变。

6、治疗肽阻断circ-CUX1-EWSR1相互作用
   作者基于EWSR1的RRM结构域在与circ-CUX1相互作用中的重要性设计了一种可穿透细胞的肽，即EWSR1抑制肽（EIP-22） ，可以阻止circ-CUX1-EWSR1交互作用（Fig 6A）。 用EIP-22处理SH-SY5Y细胞导致其在细胞核内明显聚集（Fig 6B）。此外，EIP-22处理减少了circ-CUX1和EWSR1之间的相互作用，但不减少pri-miR-222和EWSR1之间的相互作用或circACC1和AMP激活的蛋白激酶1的相互作用（Fig 6C和D）。施用EIP-22可抑制SH-SY5Y细胞的活力、增殖和侵袭（Fig 6E和F），同时改变circ-CUX1下游基因表达。
   静脉内施用EIP-22可显着降低小鼠皮下异种移植肿瘤的生长、重量，Ki-67增殖指数和CD31阳性微血管，改变circ-CUX1目标基因的表达，并降低葡萄糖摄取，乳酸盐产生和ATP水平（Fig 6G）。此外，施用EIP-22可减少小鼠肺转移量，并延长裸鼠的存活时间（Fig 6H）。这些数据表明，EIP-22通过阻止circ-CUX1-EWSR1相互作用来抑制NB进程。

   之后，作者进一步验证了circ-CUX1敲除对异种移植肿瘤裸鼠的治疗效果，结果显示裸鼠的肿瘤重量和大小，Ki-67增殖指数和CD31阳性微血管都下降了，并改变了circ-CUX1目标基因的表达，此外，小鼠的葡萄糖摄取，乳酸盐产生，ATP水平，肺部转移都显著下降。以上表明，在小鼠体内，慢病毒介导的circ-CUX1敲低可抑制好氧糖酵解和NB的进展。
   总之，本文确定了CUX1为转录因子，可促进NB中糖酵解基因ENO1，GPI和PGK1的表达。证明circ-CUX1与EWSR1蛋白相互作用以增加MAZ反式激活，后者随后调节CUX1和其他与顺式和反式与肿瘤进展相关的基因的转录（Fig 6I），例如S100A9、MUC4、KLF10和TXNIP。本文中circ-CUX1 / EWSR1 / MAZ轴的发现代表了对肿瘤进行治疗性干预前进了有希望的一步。
参考文献：
   Li Huanhuan., Yang Feng., Hu Anpei., Wang Xiaojing., Fang Erhu., Chen Yajun., Li Dan., Song Huajie., Wang Jianqun., Guo Yanhua., Liu Yang., Li Hongjun., Huang Kai., Zheng Liduan., Tong Qiangsong.(2019). Therapeutic targeting of circ-CUX1/EWSR1/MAZ axis inhibits glycolysis and neuroblastoma progression. EMBO Mol Med, 11(12), e10835. doi:10.15252/emmm.201910835