国自然热门领域之circRNA
人类基因组中大约50%的DNA可以转录为RNA，其中只有2%能够翻译成蛋白质(mRNA)，其余98%不能翻译成蛋白质，这些不能翻译成蛋白质的RNA被称之为非编码RNA。常见的具有调控作用的非编码RNA包括环状RNA（circRNA）、微小RNA（miRNA）及长链非编码RNA(lncRNA)等。非编码RNA在国自然基金申请上非编码RNA可是大热门，前有miRNA，后有lncRNA与circRNA。今天我们讲最近几年新出现的“小老弟”circRNA，pubmed检索到的文献数量呈指数级增长，circRNA也入选了科睿唯安联合中科院发布《2019研究前沿》。去年国自然中标的标书中有73项与circRNA相关，预测2020年中标数仍会上涨，预计到达100例左右。
今天我们将一篇关于circRNA的m6A甲基化修饰促进结直肠癌肝转移的新机制的文章，该文章题名为：N6-methyladenosine modification of circNSUN2 facilitates cytoplasmic export and stabilizes HMGA2 to promote colorectal liver metastasis，发表在Nature Communications期刊上。
1、在CRC组织中分析circRNA失调，circNSUN2在CRC侵袭性中的作用
首先通过circRNA芯片检测了结直肠癌组织中circRNAs的表达情况。接下来，比较九种circRNA在肿瘤组织中的表达与来自97名CRC患者的匹配的正常组织中的表达。分析发现位于CRC染色体5p15.31上的circRNA_103783的高表达提示患者总体生存率（OS）较差，circRNA_103783高表达与淋巴结转移呈正相关。circRNA_103783源自NOP2 / Sun RNA甲基转移酶家族成员2（NSUN2）位点的第4和5个外显子区域；因此称其为circNSUN2。原发性CRC，尤其是肝转移（LM） CRC患者中，circNSUN2的水平经常被上调；患有LM的CRC患者的血清中circNSUN2水平显着上调。
2、CRC中circNSUN2的表征
接下来验证了circNSUN2为环状RNA，通过引物和RNA酶验证。核质分离PCR和FISH发现circNSUN2主要位于细胞质中，但也存在于细胞核中。这些结果共同表明，circNSUN2是在CRC中表达的丰富而稳定的circRNA。
3、CircNSUN2促进PDX模型中的CRC细胞转移
鉴于circNSUN2在CRC侵袭性中具有重要的临床意义，作者研究了circNSUN2在CRC细胞转移中的体内功能。在肝转移模型或肺转移模型中，PDX CRC细胞中circNSUN2敲低后，肿瘤转移被显着抑制。过表达circNUSN2注射TC71细胞的裸鼠在肝脏或肺中转移结节明显增加。表明对CRC转移的调节作用直接来自circNSUN2。体外研究（CRC细胞迁移、Transwell和三维（3D）反向侵袭试验）均显示敲除circNSUN2可显着抑制CRC细胞的侵袭。
4、YTHDC1促进m 6 A修饰的circNSUN2的细胞质输出
为了探索circNSUN2调控CRC恶性肿瘤的潜在分子机制，通过RNA pulldown和质谱分析验证了YTHDC1和IGF2BP2作为circNSUN2结合蛋白。进一步的RIP实验表明，与对照IgG相比，抗YTHDC1抗体沉淀的复合物中circNSUN2富集。MeRIP实验表明circNSUN2的外显子4-5连接序列也高度富集在m6A沉淀中，证实了circNSUN2中的存在m6A修饰。突变circNSUN2中GAACU m6A序列YTHDC与circNSUN2的相互作用能力降低。核质分离PCR和FISH显示，沉默YTHDC1会显着增加核circRNA含量。这些结果表明，YTHDC1可以与circNSUN2结合，从而促进circNSUN2以m6A依赖性的方式从细胞核输出至细胞质。
5、CircNSUN2通过CAUCAU序列与IGF2BP2相互作用
RNA Pull-down实验，观察到circNSUN2拉下丰富IGF2BP2蛋白；RIP实验也证明了IGF2BP2和circNSUN2之间的相互作用。通过IF-FISH实验，证实了内源表达的circNSUN2和IGF2BP2在细胞质中的共定位。表明circNSUN2 / IGF2BP2在细胞质中形成RNA-蛋白质复合。RIP实验显示IGF2BP2的KH3-4双结构域与circNSUN2特异性结合，表明KH3-4双结构域负责募集circNSUN2。CircScan 数据库分析发现，IGF2BP2在circNSUN2的外显子5–外显子4交界位点与circNSUN2结合，也就是CAUCAU序列。通过体外RNA-EMSA，验证了IGNS2BP2 与circNSUN2相互作用需要内部的CAUCAU序列。
6、CircNSUN2 / IGF2BP2 / HMGA2复合物可稳定HMGA2 mRNA
经数据库筛选，鉴定了21个与IGF2BP2结合的mRNA。考虑到circNSUN2促进转移进展，筛选出十个与转移相关的基因作为circNSUN2的潜在靶标。qRT-PCR和WB验证HMGA2是circNSUN2的靶基因。通过BLAST分析，发现circNSUN2内部的AAACA位点直接结合到HMGA2的3'UTR。RNA Pull-down验证了circNSUN2和HMGA2之间的相互作用。进一步发现敲除circNSUN2会显着降低HMGA2的mRNA稳定性，从而导致HMGA2表达降低。circNSUN2敲低时，HMGA2 44的下游靶标CXC基序趋化因子受体4（CXCR4）的表达也被下调。circNSUN2在促进IGF2BP2和之间的相互作用中起关键作用HMGA2，并且增强的mRNA稳定性HMGA2通过circNSUN2 / IGF2BP2 /形成HMGA2 RNA-蛋白三元复合物。
7、CircNSUN2通过HMGA2途径促进CRC的LM
体内模型表明，通过注射circNSUN2-nockdown PDX CRC细胞而形成的肝脏中转移结节减少，通过HMGA2的过表达而得以很大程度上恢复。通过Transwell分析、3D反向侵袭分析和3D形态发生Matrigel培养物进行的体外分析进一步证明，HMGA2的强制表达在circNSUN2沉默后在功能上拯救了减少的细胞侵袭和迁移。为了进一步揭示circNSUN2调控在CRC中的临床相关性，检查了97名CRC患者中circNSUN2，HMGA2和CXCR4的表达水平。发现，circNSUN2的表达水平与HMGA2和CXCR4转录物的表达水平呈正相关。值得注意的是，HMGA2和CXCR4的表达水平预示着较差的CRC患者OS。
接下来，有检查从相同的20名CRC患者中通过手术获得的PC和匹配的LM组织中HMGA2和CXCR4的表达水平。结果表明，HMGA2和CXCR4的表达上调在LM中比在PC中更为普遍。
好了今天就讲到这，下回带大家看点别的。再见！！！