lncRNA DRAIC治疗前列腺癌的新靶点

   DRAIC是在抵抗性晚期前列腺癌中下调的1.7 kb的lncRNA。DRAIC表达的降低预示着前列腺癌和其他七种癌症的患者预后不良，而DRAIC的升高则抑制了异种移植肿瘤的生长。在此背景下作者研究了lncRNA DRAIC前列腺癌中的功能与机制，并于2020年1月发表在Cancer Research（IF:8.378）上。
主要结果如下：
1、lncRNA DRAIC在体内体外抑制肿瘤潜能
   如图1，与对照（EV）相比，过表达lncRNA DRAIC（FL）显著抑制了肿瘤的侵袭和增殖以及成瘤水平。

                                                                    图1 lncRNA DRAIC在体内体外抑制肿瘤潜能

2、前列腺癌中DRAIC的低表达与高活性的NF-κB有关
   GSEA分析显示前列腺癌中TNFα-NF-κB被显著激活（图2A），TCGA显示通过NF-κB 通路的TNFα信号的蛋白编码基因与DRAIC表达呈负相关（图2B），尤其是NF-κB通路的经典蛋白（图2C）。此外，DRAIC在IKK磷酸化IκBα中抑制NF-κB或其上游的活性（图2D-G）。

                                                                图2前列腺癌中DRAIC的低表达与高活性的NF-κB有关
   为了检测DRAIC敲除后激活了哪一步，作者干扰了IκB激酶（IKK），NF-κB和IκBα的活性，如图3A，然后检测NF-κB的荧光素酶活性，如图3B-G。结果表明DRAIC的敲低激活了IKK在IκBα磷酸化处或上游的NF-κB途径。当过表达IKK（S177E / S181E）时，DRAIC过表达仍然抑制NF-κB活性（图3H，与图2E相比），这表明 DRAIC抑制了活性IKK下游的NF-κB通路。因此推断，DRAIC可能通过干扰IKK的功能来抑制NF-κB途径。

                                                                      图3 DRAIC在 IKK水平抑制NF-κB通路
   与DRAIC干扰IKK活性的预期一致，敲除DRAIC增加了IκBα的活性，相反，TNFα刺激过表达DRAIC则抑制由TNFα刺激引起的IκBα活性（图4A-C）。类似的，敲除DRAIC后降低了几种内源性的NF-κB响应基因，如GSTP1，MCP-1，IL-6，IL-8和TNFα，同时增加了上述基因的启动子绑定NF-κB（图4D-E）。此外，由敲除DRAIC诱导的细胞侵袭在抑制NF-κB活性后下降了（图4F-H）。以上说明，DRAIC介导的生物学功能改变是通过介导NF-κB通路活性实现的。

                                                                    图4 DRAIC敲除增加了NF-κB通路的活性

3、使用CRISPR/Cas9敲除DRAIC外显子2-4通过激活NF-κB增加肿瘤的侵袭
   虽然使用CRISPR/Cas9敲除DRAIC外显子2-4后，DRAIC外显子5的表达降低，细胞的增殖没有改变，但是IκBα活性，IKK激酶的活性和NF-κB活性都显著增加（图5A-G）。此外，肿瘤细胞的侵袭和集落形成能力也都显著提高（图5H-K），相反的，侵袭和集落形成被外源性启动子表达DRAIC抑制(图5L-O)。类似的，肿瘤细胞的侵袭和集落形成能力同样可以被NF-κB通路的IKK抑制剂BAY11-7082所抑制（图5P-S）。此外，NF-κB通路响应基因在敲除DRAIC后显著上调表达。综上结果表明，敲除DRAIC介导的细胞生物学功能改变是通过调控NF-κB活性实现的。

                                                        图5 DRAIC敲除通过增加NF-κB通路的活性提高了前列腺癌的致瘤性

4、DRAIC与IKK复合物相互作用，降低了复合物的完整性
   RIP实验证实DRAIC与IKKα，IKKβ和NEMO相互作用，而不与p65或IκBα作用。进一步的，siRNA介导敲除IKK复合物三个亚基中的两个，然后对余下的亚基进行免疫沉淀，结果表明与DRAIC相关的所有三个亚基均独立于其他亚基（图6D）。之后，验证DRAIC是否破坏了IKK复合物的完整性。DRAIC过表达，然后对NEMO（图6E）或IKKα（图6F）免疫沉淀，表明DRAIC降低了NEMO和IKKα的结合。

                                                                          图6 DRAIC与IKK复合体相互作用

5、DRAIC外显子4-5的701-905碱基抑制侵袭和NF-κB活性
   DRAIC中的缺失突变表明，与DRAIC KO中的IKKα免疫沉淀，含有外显子4-5（碱基701-1705）但不包含外显子1-3（碱基1-700）的片段与全长DRAIC的结果一样好（图7A）。当从外显子4-5中以200个核苷酸的步长进行进一步删除时，结果表明碱基701-905是与IKKα紧密相关的最小片段（图7B）。有趣的是，当在DRAIC KO细胞中表达时，外显子4-5（相对于外显子1-3）和片段701-905（相对于900-1705）最能抑制NF-κB报告活性（图7C-D）。此外，细胞侵袭和集落形成的能力也由DRAIC 701-905位点介导（图7E-H），此外，细菌产生的重组IKKα或NEMO，在体外也由DRAIC（701-905）介导（图7I）。不仅如此，体内IKKα与NEMO结合固定也由该位点调控（图7J）。

                                                        图7 E4-5的701 – 905碱基与IKK相互作用抑制侵袭和NF-κB活性
   总之，本文发现lncRNA DRAIC表达降低的癌症中NF-κB靶基因表达增加。 DRAIC下调增加细胞侵袭和软琼脂集落形成；且这取决于NF-κB的激活。 DRAIC与IKK复合物的亚基相互作用，以抑制它们之间的相互作用、IκBα的磷酸化和NF-κB的激活。DRAIC的这些功能由701-905碱基片段决定。因此，DRAIC lncRNA通过干扰IKK活性，通过抑制NF-κB活化来抑制前列腺癌的进展。
参考文献：
   Saha Shekhar., Kiran Manjari., Kuscu Canan., Chatrath Ajay., Wotton David., Mayo Marty W., Dutta Anindya.(2020). Long noncoding RNA DRAIC inhibits prostate cancer progression by interacting with IKK to inhibit NF-κB activation. Cancer Res., undefined(undefined), undefined. doi:10.1158/0008-5472.CAN-19-3460.