小RNA测序的11分杂志攻略

导语:
    细胞外泡(EVs)在正常的肺生理中起着重要的作用，通过细胞间通讯维持气道内的稳态。ev包括外泌体和微囊泡，并以其磷脂双层为特征。EVs被认为是一种新型的疾病循环生物标志物，由不同类型的细胞释放。EV miRNAs的生物分析对于开发可用于COPD诊断、预后和治疗的生物标志物具有巨大的转化潜力。近期，一篇名为“Small RNA-sequence analysis of plasma-derived extracellular vesicle miRNAs in smokers and patients with chronic obstructive pulmonary disease as circulating biomarkers”的文章在杂志Journal of extracellular vesicles（IF=11）上发表，首次报道血浆来源的EV miRNAs是一种新的循环肺部疾病生物标志物。

技术路线:

研究结果:
1.人血浆衍生EV的分离和表征鉴定
    对6名非吸烟者、6名吸烟者和8名慢性阻塞性肺病患者的EV/外泌体分离和特征进行了全面分析，并对人血浆来源的EV进行了小RNA测序。对等离子体衍生的ev进行了透射电镜(TEM)、纳米颗粒跟踪分析(NTA)和可调电阻脉冲传感(TRPS)，其范围在50-150 nm之间, TEM分析证实了从非吸烟者、吸烟者和COPD患者的血浆样本中分离出的杯状ev的形态ogy。非吸烟者、吸烟者和慢性阻塞性肺病患者EVs浓度的数据显示，在颗粒大小分布或总颗粒数方面没有显著差异，但在三组中均显示外泌体的大小范围内富含vesi- cles。进行了微BCA蛋白质分析量化exosomal总额之间相对比较孤立的EV出现在所有三组。从非吸烟者、吸烟者和COPD患者中分离出的等离子体衍生EVs中，TSG- 101、rab5b和Alix的外泌体标记物富集。从人血浆样品中分离的ev不含calnexin或GRP94，表明内质网蛋白未受污染。

 
 
2.EV标记证明被人支气管上皮细胞(BEAS-2B)所摄取
    使用来自血浆的EV非吸烟组和吸烟者组使用ExoGlow-membrane EV labelling kit试剂盒进行标签。将标记的ev加入到BEAS-2B细胞中，以验证人支气管上皮细胞对血浆来源的EV的吸收。红色荧光标记的电动汽车被确定在BEAS-2B细胞,表明EVs的吸收。生活共焦显微镜图像从不同地区获得24小时后的后处理贴上EVs BEAS-2B细胞阳性显示约50 - 60%的标签EVs不吸烟和吸烟组。

 
 
3.输入Read校准和小RNA生物型映射           
    Exosomal RNA浓度在人类plasma-derived EVs不吸烟,吸烟者和COPD患者59和310 pg /μl之间不等，各种小RNA生物型的百分比分布对人类基因组的reads进行分类。每组小RNA生物型的平均reads总数在110万到140万之间。我们观察到一个不同的模式和生物型丰富的百分比分布非吸烟者,吸烟和慢性阻塞性肺病患者。microRNA(24.9 - 31.9%, 15.9 22.9%和58.9 6.4%),tRNA(23.3 - 24.3%, 26.5 23.8%和11.1 2.5%)和protein_coding(25.2 - 16.9%, 25.7 16.7%和10.2 2.8%)生物型的最高浓缩生物型非吸烟者,吸烟和慢性阻塞性肺病患者,分别。misc_RNA和lincRNA的生物型分别为3.0% - 8.2%和0.5% - 2.9%。最后,piRNAs (0.6 - 2.6%), Mt_rRNAs (0.1 - 0.6%), Mt_tRNAs(0.1%)、核内小RNA(0.1 0.5%)和snoRNA(0.1 0.3%)至少代表生物型的非吸烟者,吸烟和慢性阻塞性肺病患者。生物型分布百分比为个人所有三组样本表示在图2(表3)。

4.非吸烟者、吸烟者与COPD患者的miRNA比较
    从所有三组(非吸烟者、吸烟者和COPD患者)中总共识别出329种不同的miRNA。只有219个miRNA序列的平均读数大于5 /百万。139个、115个和198个总miRNA分别存在于非吸烟者、吸烟者和慢性阻塞性肺病患者的等离子体衍生外体RNA中。比较吸烟者和COPD时，两组之间共有111个miRNA。非吸烟者、吸烟者和COPD组患者均有一定数量的miRNAs(分别为17、3和65)，这些miRNAs是各组特有的。在比较不吸烟者和吸烟者时发现了五种差异表达的miRNA。当我们比较非吸烟者和慢性阻塞性肺病患者时，发现了21种不同具体表达的miRNA。此外，当对比吸烟者与COPD时，发现15个miRNA有差异表达。在非吸烟者与吸烟者之间以及吸烟者与COPD之间的比较中，只发现了一个共同的差异表达的miRNA;在非吸烟者vs. COPD和吸烟者vs. COPD比较中共鉴定出24种miRNA，三种不同的两两比较中均未发现相同的miRNA。使用三个比较组中发现的前20个最丰富的miRNA来分析这些独特的miRNA。结果显示17 microRNA丰富的存在在所有三组,1独特的microRNA的每个非吸烟者和吸烟者组和2独特的microRNA在COPD患者组,前20名中有丰富的microRNA。在不吸烟者与smo- kers、不吸烟者与COPD、吸烟者与COPD成对比较中，miRNA的表达有显著差异，采用层次聚类方法进行聚类分析。通过测试统计和P值来选择每对比较中识别出的候选miRNA。此外，我们还使用调整后的P值P < 0生成热图和两两比较的层次聚类分析。0 1。只有6个独特的miRNA在非吸烟者与COPD和吸烟者与COPD两两比较中有差异表达。我们没有观察到任何miRNA候选体在非吸烟者与吸烟者两两比较中使用调整后的p值有差异表达。

 

5.非吸烟者、吸烟者与COPD患者tRNAs的比较
所有三组(非吸烟者、吸烟者和COPD患者)中总共识别出25个不同的tRNA。通过分析三组的平均读计数，我们发现了六种不同的tRNA: tRNALys、tRN AGly、tRN ACys、tRN AAla、tRNAGluand tRNAValto是本研究发现的25种富含等离子体源EV tRNA中最丰富的tRNA片段。在非吸烟者和吸烟者中有差异。比较非吸烟者和COPD时，发现了5个差异表达的tRNAs(两个独特的tRNALysand tRNAGlu;三种常见的tRNAGly, tRN异型tRNA)和在吸烟者与COPD组中的比较(两种独特的tRNALeu和tRNAMet;三种常见tRNAGly t R N ATyrand tRNA),和所有的转运RNA被发现在普遍不吸烟者和吸烟者不吸烟与慢性阻塞性肺病和吸烟与慢性阻塞性肺病成对比较。非吸烟者与吸烟者、非吸烟者与COPD、吸烟者与COPD两两比较中，tRNAs有显著性差异表达，采用层次聚类方法进行聚类分析。在25个富集tRNAs中，5个tRNAs在非吸烟者与COPD和吸烟者与COPD中存在差异表达，并且在25个富集tRNAs中存在两两独特和三种常见的两两比较。我们没有观察到任何tRNA候选基因在非吸烟者和吸烟者两两比较中均有差异表达。 

6.非吸烟者、吸烟者与COPD患者的piRNAs比较
    从所有三组(非吸烟者、吸烟者和COPD患者)中总共识别出34种不同的piRNAs。通过分析所有三组的平均read数，发现三种不同的piRNAs: piro -016658、piro -016659和piro -019825，它们是血浆衍生EV富含34种piRNAs中最丰富的。无法在不吸烟者和吸烟者中检测到任何独特的差异表达的piRNAs。当比较非吸烟者与COPD组(pi -012753)和吸烟者与COPD组(pi -016735)时，发现一个独特的piRNA表达差异。在com- mon中仅发现一个piRNA (pi -020813)，非吸烟者与吸烟者、非吸烟者与COPD、吸烟者与COPD两两比较中存在显著性差异的piRNAs表达，发现了两种piRNAs(一种独特的:12 I. K. SUNDAR等人的piR-012753和一种常见的:piR-020813)在非吸烟者与非吸烟者、吸烟者与COPD两两比较时存在差异。

 
7.miRNA的功能过表达分析(ORA)和基因集富集分析(GSEA)
    对差异表达的miRNA(非吸烟者vs.吸烟者、非吸烟者vs. COPD、吸烟者vs. COPD)进行了功能性过表达分析(ORA)和基因集富集分析(GSEA)。发现差异表达的重要浓缩microRNA从属于类别的非吸烟者和吸烟者基因本体论(去)和目标基因。奥拉非吸烟者的差异表达miRNA与慢性阻塞性肺病属于类似的识别重要的充实等途径。奥拉在非吸烟者与慢性阻塞性肺病的比较显示,浓缩的smoking-mediated信号通路如细胞凋亡信号通路,通过趋化因子和细胞因子信号通路介导的炎症,氧化应激反应,这与各自相关基因本体和疾病。miRNA的功能过表达分析吸烟者和 COPD也显示出明显的miRNA靶点富集，miRNA表达(不吸烟与慢性阻塞性肺病com -半成品)显示出上调。使用非吸烟者与吸烟者配对比较中差异表达的miRNA进行GSEA。由于这些比较中差异表达的miRNA数量较少，我们没有获得任何富集数据。当我们进行GSEA利用非吸烟者的差异表达miRNA与慢性阻塞性肺病,两类(通路和基因本体)显示富集,观察到在奥拉数据分析以及免疫细胞(CD19, CD3和CD56),发现新通路在GSEA途径丰富利用吸烟与慢性阻塞性肺病的差异表达miRNA成对比较。这包括p53通路反馈环2、参与DNA损伤反应(DDR)的miRNA、G1对S细胞周期的控制、肌动蛋白骨架的调节和DNA损伤反应。

8. miRNA的数据库搜索/分析
    在数据库中搜索了调整后的显著性p值(非吸烟者与COPD之间的miR-151a-5p;miR-151b、miR-335-5p、miR-320d、miR-628-3p miR-877-5p和miR-937-3p)和吸烟者与COPD (miR- 22-3p、miR-99a-5p、miR-320b、miR-320d、miR-877-5p和miR-937-3p)的比较。EV miRNA、ExoCarta、Vesiclepedia和miRDB数据库的搜索结果证实，上面列出的大多数miRNA之前都在血清/血浆、脑脊液和/或结直肠can- cer细胞来源的外泌体/EV中得到了富集/鉴定。此外，一些miRNAs也在尿液中被发现，其中一个在神经母细胞瘤细胞来源的exo- somes/ ev中被发现。

9.通过实时荧光定量PCR和nanostring分析对选定的RNA-seq miRNA进行验证
    使用人支气管上皮细胞(BEAS-2B)，加入或不加入CSE(0.5%) 3天，从条件培养基中分离外泌体/ ev到RNA-seq分析中鉴定的有效的选定miRNA。选择了11种不同的miRNA (miR-let-7a-5p, miR- let-7i-5p, miR-29a-3p, miR-92a-3p, miR-99a-5p, miR- 100-5p, miR-151b, miR-184, miR-375, miR-486-5p和miR-584-5p)。 qPCR结果显示，11个miRNA中有8个在BEAS-2B细胞的CSE来源的外泌体中表达显著增加控制。其余三个microRNA并没有显示出显著改变他们exosomal CSE之间microRNA的表达水平与对照组。选择了11种不同的miRNAs (miR-let-7a-5p、miRlet-7i-5p、miR-23b-3p、miR-25-3p、miR-29a-3p、miR-92a-3p、miR-99a-5p、miR-103a-3p、miR-128-3p、miR-151b和miR-375)。qPCR分析未发现U937细胞的外泌体与cse来源的外泌体相比有显著变化。数据表明，在吸烟者和COPD患者中发现的一些系统miRNA生物标志物(血浆来源的外体miRNA)有可能成为新的环状外体miRNA生物标志物。通过使用nSolver分析软件4.0对样本中100个高表达miRNA的总数进行NanoString分析显示，两组之间有13个miRNA存在差异表达。与对照组相比，cse处理组中有5个miRNA被下调(miR-574-5p、miR- 575、miR-146a-5p、miR-320e和miR-181a-5p)， 8个miRNA被上调(miR-15a-5p、miR- 130a-3p、miR-19b-3p、miR-99a-5p、miR-30a- 3p、miR-25-3p和miR-32-5p)和。值得注意的是, 在CSE处理组中发现的13个miRNA中有两个(miR-99a-5p和miR-25-3p)差异表达。

总结:
    总之，从非吸烟者、吸烟者和COPD患者中分离和鉴定血浆来源的EVs/外泌体。我们使用小RNA测序分析来鉴定ncRNA类的富集，如miRNA、tRNA、lincRNA、piRNAs、snRNAs、snoRNAs等生物类型。特别关注miRNA、tRNAs和piRNAs的差异表达(DESeq2)，以及单独用于进一步分析(包括验证)的miRNA。选择了差异显著的两两比较的miRNA，并通过ev的qPCR分析和使用NanoString技术的人类miRNA面板对对照组与经cse处理的BEAS-2B细胞的总RNA进行了进一步验证。基因集富集分析揭示了在调节慢性阻塞性肺病患者和吸烟者的cyto- kine信号(炎症)、细胞外基质和组织重塑的生物学通路中起关键作用的几个靶点。未来的研究正在进行中，以确定EV生物标记物使用不同的体液，如血清/血浆、BAL液、尿液，来自非吸烟者、吸烟者和COPD患者，以发现局部与系统循环的EV生物标记物之间可能的关系。