原来lncRNA阻碍侵袭也不一定是好事！

   Pumilio（PUM）蛋白是高度保守的RNA结合蛋白家族的成员，该家族在转录后调节许多生物体中的基因表达。但是，它们在胎盘中的作用尚不清楚。胚胎着床时，滋养细胞粘附在母体子宫内膜上，然后侵入母体子宫内膜，最终形成胎盘。目前，在人类胎盘发育过程中发现了两种主要的滋养细胞谱系:绒毛滋养细胞和外渗滋养细胞（EVTs）。EVT的侵袭是胚胎植入和胎盘形成的重要过程。EVT侵袭不充分和子宫螺旋动脉重构受损是子痫前期（PE）发生的启动因素。本文确定了一种新的RNA调控机制，揭示了在PE发病机理中，调控PUM1 / HOTAIR在滋养细胞入侵中调控的新途径，并于今年12月发表在Molecular Therapy (IF: 8.402)。
主要结果如下：
1、PE患者滋养细胞中PUM1表达水平升高
   收集妊娠中期绒毛组织，探讨PUM1和PUM2在PE发病中的作用，PUM1在PE中的mRNA和蛋白水平均上调（Fig 1A-B）。此外，与HC组相比，早发型PE组和晚发型PE组的绒毛组织中PUM1阳性信号更强（Fig 1C-F）。总之，PUM1在PE患者滋养细胞中高表达。

                                                           图1 PE患者滋养细胞中PUM1表达水平升高

2、PUM1抑制HTR-8细胞的增殖和侵袭
   如图2所示，与对照组相比，干扰PUM1后HTR-8细胞的增殖和侵袭能力显著升高，表明PUM1抑制HTR-8细胞的增殖和侵袭。

                                                                 图2 PUM1抑制HTR-8细胞的增殖和侵袭

3、在绒毛外滋养细胞外植体培养模型中PUM1弱化了EVTs的入侵和迁移能力
   为进一步研究PUM1在滋养细胞侵袭中的作用，从新鲜妊娠早期胎盘组织中分离出细胞滋养细胞(CT)和侵袭性滋养细胞(EVT)。采用qRT-PCR检测妊娠早期胎盘绒毛组织及CT、EVT细胞的PUM1 mRNA表达水平，结果发现，EVT细胞中PUM1 mRNA的表达水平低于CT细胞，表明PUM1可能在体内调控EVT的侵袭中发挥重要作用。
   然后研究PUM1是否对滋养细胞的体外迁移能力有影响。从妊娠前3个月(妊娠6-10周)的胎盘中取出胎盘绒毛，分成两组，在涂有基质的培养皿中培养。培养24h后，siCtrl和siPUM1组之间没有观察到显着差异。体外培养72h后，siPUM1处理的外植体比siCtrl处理的外植体迁移得更远（图3A和3B）。全量免疫荧光染色显示了胎盘绒毛中PUM1的沉默效率（图3C和3D）。
   为了进一步阐明PUM1对滋养层细胞入侵的调控，从健康的绒毛中获得新鲜外植体，并将其分为两组。结果表明，lenti-PUM1处理的外植体的迁移能力低于lenti-ctrl处理的外植体（图3E和3F）。综上，PUM1抑制EVT入侵并支持PUM1可能是PE的关键介体的观点。

                                                               图3 PUM1减少了外植体中滋养层的生长

4、HOTAIR是PUM1在滋养层中的一个下游基因
   为了阐明PUM1在PE发病机制中调控滋养细胞侵袭的分子机制，将HTR-8细胞转染siCtrl或siPUM1后培养48h的细胞进行lncRNA测序，得到178个差异表达lncRNA，与对照相比，siPUM1中101个上调77个下调（图4A）；其中22个lncRNA的表达水平发生了显著变化 (图4B)，经qRT-PCR验证，有12个的表达模式一直（图4C）。用PUM1过表达质粒转染HTR-8细胞，qRT-PCR结果显示，lncRNAs HOTAIR、HAGLR和CTD-2228K2.7在PUM1过表达组滋养细胞中表达较低；与此相反，MEG3、SNHG1、SNHG6和linc01085在PUM1过表达的滋养细胞中显著升高(图4D)。之后，使用RIP实验，结果发现只有HOTAIR显著富集（图4E）。此外，敲低PUM1可显著促进HOTAIR在HTR-8细胞中的表达，而过表达PUM1可降低HOTAIR的表达(图4F和4G)。总之，PUM1在胞质内与HOTAIR特异性相互作用，调节HOTAIR的表达。

                                                              图4 PUM1下调滋养细胞中HOTAIR的表达

5、PUM1在滋养细胞中调节HOTAIR的表达和稳定性
   为了进一步阐明PUM1调节滋养细胞中HOTAIR表达的潜在分子机制，根据UGUARAUA共有序列，在HOTAIR的第六个外显子区域（0.5 2.3 kb）中预测了四个PUM1结合位点，这些PUM1结合位点称为A，B，C和D（图5A）。荧光素酶结果显示，在对照组和PUM1沉默下，HTR-8细胞中MUT C的荧光素酶活性，特别是MUT D报告质粒的荧光素酶活性显着增加（图5B和5C），表明HOTAIR第六外显子区域中的位点C和D是PUM1的潜在结合位点。RIP结果显示，与IgG组相比，HOTAIR的C和D位点显着降低了抗PUM1组的HOTAIR富集（图5D），这些表明，HOTAIR的C和D位是结合PUM1蛋白的主要位点。RNA亲和纯化实验证实PUM1与HOTAIR特异性相互作用（图5E）。此外，转染siPUM1后，HOTAIR的半衰期较长，但当用过表达PUM1的质粒转染细胞时，HOTAIR的半衰期较短（图5F和5G），揭示了PUM1对HOTAIR RNA稳定性的强烈影响。综上，PUM1在转录后调控HOTAIR。

                                                          图5 PUM1是HOTAIR滋养细胞中重要的RNA结合蛋白

6、HOTAIR在PE中下调表达并与PUM1表达呈负相关
   作者此前发现，HOTAIR通过激活PI3K- AKT信号通路来促进滋养细胞侵袭。实验发现，PUM1敲低或HOTAIR过表达增强了Ser473的AKT磷酸化，而PUM1过表达或HOTAIR敲低大大降低了AKT的磷酸化。此外，用HOTAIR过表达加PUM1过表达处理HTR-8细胞可以逆转PUM1过表达对AKT磷酸化的影响。相反，用HOTAIR siRNA加PUM1 siRNA处理HTR-8细胞也明显逆转了HOTAIR敲低对AKT磷酸化的作用（图6A和6B）。
   此外，与对照组相比，过表达PUM1的HTR-8细胞和原代滋养细胞中侵袭细胞的数量明显减少，而HOTAIR的过表达逆转了由PUM1过表达引起的对滋养细胞入侵的影响（图6C-6F）。进一步验证PE患者和HCs中滋养细胞中HOTAIR和PUM1 mRNA的表达水平，和预期一致，与HC组相比，PE组的滋养细胞中PUM1 mRNA的水平明显较高，而HOTAIR的水平显着较低（图6G和6H）。线性相关分析表明，绒毛组织中HOTAIR水平与PUM1 mRNA水平呈负相关（图6I）。综上所述，PUM1 / HOTAIR / p-AKT途径在调节滋养细胞入侵中具有重要的功能。

                                                       图6 PUM1/HOTAIR/AKT通路参与调节滋养细胞的侵袭
   总之，本文表明PUM1是HOTAIR表达和滋养细胞功能的关键调控因子。首先，在PE中，PUM1上调，HOTAIR下调。其次，HOTAIR是滋养层迁移和入侵的有效调节因子，而在PE患者中，该过程不受控制。最后，AKT磷酸化的下调伴随着PUM1过表达后迁移和侵袭的减少。