系统性红斑狼疮造血干细胞和祖细胞的转录组分析

    造血干细胞和祖细胞（HSPCs）是多能性细胞，可产生髓系和淋巴系。我们认为系统性红斑狼疮（SLE）免疫细胞异常可以追溯到HSPCs。HSPCs通过髓样偏移对炎症刺激作出积极反应，但这可能导致疲劳、功能下降、炎症风险增加、适应性免疫下降和心血管死亡率增加。今天小编为大家带来最新发表于Translational science杂志上的文章“Transcriptome reprogramming and myeloid skewing in haematopoietic stem and progenitor cells in systemic lupus erythematosus”。在本研究中，我们通过RNA测序、通路富集分析，构建骨髓源性HSPCs的全球基因表达图谱，通过流式细胞术检测HSPCs的细胞周期状态和凋亡状态，通过免疫荧光法检测DNA损伤情况。

结果：
1.小鼠狼疮HSPCs的转录谱表现为髓样偏倚
    为了研究HSPCs在SLE中是否出现转录改变，我们使用小鼠模型NZBW/F1。年龄相当的雌性C57BL/6小鼠作为对照组。采用流式细胞术从NZBW/F1狼疮和C57BL/6对照小鼠髓样中筛选HSPCs，并在LSK室中进行基因分析（图1A）。共鉴定了F1-P和F1-L小鼠之间的758个差异表达基因（图1B）。在F1-L小鼠中，基因集富集分析显示与炎症反应、先天免疫反应激活和血小板脱颗粒相关的信号呈正相关（图1C）。值得注意的是，F1-L小鼠中LSK表现出较强的增殖和较强的髓特征（图1D）。IFN相关基因（Gbp6和Ciita）在F1-L LSK中上调，表现出强I型IFN信号，这是活性SLE的一个标志（图1D）。总之，这些转录组学数据表明，F1-L LSK向髓系/粒细胞系的增殖和分化增强。

2.小鼠狼疮HSPCs细胞的活性增殖和复制应激
    为了验证转录组数据，我们分析了髓样LSK腔室及其亚群。与F1-P相比，F1-L小鼠的LSK增加了近两倍（图2A，B）。在LSK室，F1-L小鼠中，短期造血干细胞和多能祖细胞的频率更高（图2A，C）。在稳定状态下，HSPCs相对静止，维持一个低数量的循环细胞，这些细胞将分化为成熟的血细胞。狼疮LSK细胞周期分析显示，与B6-O对照组相比，在G0期，F1-L LSK细胞增殖增加，数量减少（图2D）。此外，与B6相比，狼疮LSK表现出更多的双链DNA断裂（图2E），这表明狼疮小鼠的LSK处于复制应激状态。

3.狼疮疾病进展中CMPs的分化停滞
    为了描述LSK期后的造血分化，我们对每个谱系的祖细胞进行了描述。F1-L组CMPs增加2.5倍，而与F1-P组相比，GMPs减少2倍（图3A）。接着，为了进一步研究骨髓分化的调控，我们进行了转录分析。721个DEGs中的大部分在F1-L CMPs中下调(图3B)。另外，髓样标志物下调，而增殖标志物无差异表达（图3C）。DEGs参与了与髓磷脂介导免疫、粒细胞激活、中性粒细胞迁移和补体激活相关的通路。因此，我们检查了特异性粒细胞标记的表达（图3D）。在F1-L CMPs中，IL-1家族的趋化因子和调节因子被下调。主要调节因子如Cebpe，Cebpd，Csf3r和Csf2rα在CMPs F1-L阶段被抑制（图3 D）。总的来说，这些结果提示骨髓祖细胞水平的分化停滞。

4.狼疮BM中中性粒细胞增多
    鉴于分化停滞，我们假设终末分化细胞可能会减少。然而，与F1-P相比，F1-L小鼠的中性粒细胞增加了1.6倍，而BM的单核细胞水平与之相当（图4A，B）。衰老比对照组小鼠中性粒细胞增加1.16倍。与之相反，F1-L小鼠血液和脾脏中性粒细胞明显减少（图4C，D）。

5.人SLE CD34+转录组表现为活跃的增殖和髓样偏移
    接下来，我们研究是否可以追踪人类疾病中的狼疮LSK信号。为此，我们从女性SLE和HC患者的BM中纯化CD34+细胞。我们在SLE和HC患者中鉴定出2364个DEGs，其中包含832个上调基因和1532个下调基因（图5A）。SLE患者淋巴样标志物表达下调，而髓样标志物在患者体内表达变化较大（图5B）。此外，系统性红斑狼疮CD34+细胞表现出增强扩散，而GSEA与ATR在复制应激、细胞周期和DNA依赖的DNA复制下的激活呈正相关（图5C）。针对增强扩散，γ-H2AX评估检查CD34+细胞是否存在增殖压力。结果表明，SLE HSPCs表现出更多的双链DNA断裂（图5D）。亚组分析显示，严重和中度SLE患者髓样标志物存在变化（图5E）。值得注意的是，与中度疾病患者相比，重度SLE患者粒细胞生成特异性标志物如CEBPZ、CEBPD、GATA2的表达增加（图5E），这与我们在小鼠狼疮LSK中的发现一致。GSEA与细胞因子-细胞因子受体相互作用和严重SLE患者的运动的正调节呈正相关（图5F）。利用上调的基因对严重SLE患者进行富集分析，发现粒细胞和中性粒细胞的趋化和迁移过度（图5G）。总之，与HC相比，HSPCs在SLE患者中被激活和增殖，在重症患者中有明显的转录分化。

6.人类狼疮CD34+与小鼠狼疮CMP转录组的比较显示了在祖细胞期阻滞的共同特征
    接下来，我们将人类CD34+转录组与LSK和CMP数据进行比较。我们发现LSK DEGs和CMPs DEGs与人类CD34+ DEGs存在显著重叠（图6A，B）。在人类SLE患者中，小鼠LSK和人类CD34+细胞共享的DEGs大部分下调，而在小鼠狼疮患者中没有下调（图6C）。然而，小鼠CMPs与人类CD34+细胞间的共同DEGs表达存在共性（图6D）。因此，SLE CD34+转录组特征更容易让人联想到小鼠狼疮CMPs而不是小鼠狼疮LSK。使用RNEA，我们发现狼疮CMPs和CD34+ SLE细胞中有15个被抑制的调节因子。其中，有重大疾病特定效应器如IFNγ和il - 6等，以及干细胞稳态分化平衡的调节因子如Ets1和Pax5（图6 E）。总的来说，狼疮患者的CD34+细胞在小鼠狼疮CMPs的转录谱中表现出更多的共性。

结论：
    系统性红斑狼疮的免疫细胞异常可以追溯到来源骨髓的HSPCs。HSPCs的启动和异常的骨髓生成调节可能导致炎症和耀斑的风险。