eccDNA——科研最新热点

    近期，Nature与Cell相继发表文章讨论染色体外环状DNA（eccDNA）。人体有基因组，包括22对常染色体和1对性染色体。 国加州大学圣地亚哥分校Ludwig癌症研究所的Paul Mischel教授领导的研究团队发现，大量的癌基因并不在染色体上，而是会从染色体上脱落下来，变成一种小型的DNA，称为染色体外DNA（ecDNA），后被验证染色体外DNA为环状，因此也称为染色体外环状DNA (eccDNAs)。EccDNA在许多类型的癌症中很常见，它们由染色体基因形成并促进肿瘤发生。癌症患者血液的筛查显示，血浆中也可发现<2 kb eccDNA。在肺癌患者健康的肺组织中发现<2 kb eccDNAs，这表明eccDNA从恶性组织迁移或在健康组织中形成。
    健康供体的血浆中eccDNA进行了鉴定，鉴定结果高达20 kb。 作者假设健康组织还包含较大的eccDNA，其大小足以包含一个或几个全长基因，原因 (1) 在人类肿瘤中发现大于100kb的eccDNA，最有可能是由随机突变过程引起的，有望从基因组的所有部分形成eccDNA； (2)已知缺失会在酵母和牛中产生eccDNA。 (3)体细胞中的缺失大小可达6Mb。

发表期刊：Nature Communication影响因子：11.878实验方法: eccDNA-seq RNA-seq
技术路线:

一、健康男性中全基因组eccDNA的全基因组检测
    eccDNA测序结果充分体现了基因组水平成环的多样性。eccDNA来源十分丰富，同一个基因有可能会产生非常多的环状，同样一个环状也不仅仅只会包含一个外显子。TTN基因就是一个非常典型的例子。该基因长度达到了0.3Mb，而这样一个基因竟然能衍生得到130个eccDNA，是一个经典的编码基因区域成环的案例。其中比较有代表性的是43-66以及44-52号外显子所组成的环状分子。eccDNA测序的目的正是在组学的层面上全面的描述刻画eccDNA的成环多种可能性。

                                                                           图1 来源于TNN基因的两例eccDNA

二、EccDNA的数量和大小
    从16个肌肉样品中鉴定出10万多种不同的eccDNA(n = 138,027)(补充图1c-e)。所有染色体均以eccDNA序列表示，其总长度为人类基因组的12.6％(389.5 Mb)。带有高度自信（高置信度的）的EccDNA大小从0.05µkb到57.8µkb不等，在0.1µkb和5µkb处有两个明显的峰(图2a,b)。然而，鉴于较宽的conf间隔，使用当前样本量可能会忽略不活跃和活跃男性的eccDNA计数之间的显着差异(图2a，b)。我们发现每100个白细胞核中有3.5-5.6个不同的eccDNA，而肌肉组织中每100个核中有0.85-0.93个不同的eccDNA。

                                                                         图2 eccDNA长度分布和来源多样性

三、eccDNA基因组分布
    多数eccDNA(99％)小于25 kb(图2a，b，图3a，补充图3a，b;补充图4)，而其余1％来自断点，相距大于25 kb (图3b)。所有eccDNA的一半以上来自基因或假基因区域(血液55％，组织52％)。例如，样品T8中的11.1kb [S100A3-S100A4circle 153,512-153,523kb]包括S100A3和S100A4的完整基因以及S100A5的部分基因。 S100A4编码一种蛋白质，该蛋白质在肿瘤细胞的转移扩散中起因果作用。

                                                                              图3 eccDNA的染色体分布

四、eccDNA成环验证
    eccDNA的形成与经典的circRNA具有相似性，也是经过核酸序列的反式链接得到的产物。对于环状的结构验证可以模仿circRNA，针对结合位点，就是链接位点设计发散引物和收敛引物进行PCR扩增，然后通过Sanger测序的方式验证eccDNA的接头序列。

                                                                            图4 EccDNA验证和DNA缺失

五、染色体17和19的成环可能性较大
    eccDNA的基因组分布表明，富基因的染色体17和19比每条Mb分别使eccDNA的平均频率分别高1.7倍和2.9倍。

                                                            图5 EccDNA相对于染色体的频率，基因密度和转录

六、eccDNA具有转录活性
    转录本数据表明，至少有一部分eccDNA存在于细胞核中，并没有被隔离在组织的转录无活性的区室中。 eccDNA转录本进一步排除了检测到的eccDNA仅仅是细胞凋亡驱动的片段化的副产物的可能性，如对于<2-kb eccDNA(microDNA)44所建议的那样，或者是在eccDNA纯化过程中产生的。

                                                                 图6 HIP1形成eccDNA具有转录活性
结论:
    （1） eccDNA在健康人组织和血液中很常见，其大小足以携带一个或几个完整基因。
    （2）eccDNA由介于0.05—999.8 kb之间的染色体断点形成。eccDNA具有转录活性，并且eccDNA通过表达全长或截短的基因来促进表型变异。
    （3）表型变异复制和转录的无中心的eccDNA对细胞影响重大，因为有丝分裂中的错分会产生可变的eccDNA拷贝数。
参考文献：
    M Ller H D , Mohiyuddin M , Prada-Luengo I , et al. Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue[J]. Nature Communications, 2018, 9(1):1069.