p53抑制肿瘤发生的奥秘

    肿瘤抑制因子p53转录激活靶基因，在应激状态下抑制细胞增殖。p53也与原癌基因Myc的抑制有关，但机制尚不清楚。因此，小编和大家分享一篇近期发表于molecular cell上的文章“p53 Activates the Long Noncoding RNA Pvt1b to Inhibit Myc and Suppress Tumorigenesis”。在这里，我们确定了Pvt1b，一种lncRNA Pvt1的p53依赖性亚型，表达了Myc下游的50kb，它是由DNA损伤或致癌信号引起的，并在其转录位点附近积累。我们研究表明，在不改变基因座染色质组织的情况下，Pvt1b RNA的产生对于抑制顺式Myc转录是必要且充分的。抑制Pvt1b增加Myc水平和转录活性，促进细胞增殖。此外，在肺癌小鼠模型中，Pvt1b缺失加速了肿瘤生长。这些研究结果表明，Pvt1b在p53和Myc转录网络的交叉点发挥作用，增强p53的抗增殖活性。

结果：
1.p53在基因毒性和致癌应激条件下抑制Myc
    为了深入了解p53抑制Myc的机制，我们模拟p53依赖的应激反应。为了模拟细胞对基因毒性应激的反应，我们使用野生型小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs)，用基因毒性药物Doxo处理（图1A）。我们观察到，在Doxo处理24小时后，p53转录程序的激活导致p21的3倍诱导，同时Myc RNA和蛋白水平降低（图1B，C）。我们还发现，在小鼠肺腺癌细胞系中，p53激活是由肿瘤基因应激，以他莫西芬-CreER依赖性恢复内源性p53表达为模型的，同样导致p21的激活和Myc RNA和蛋白质表达的下降（图1D-F）。在暴露于辐照6 Gy的肠道上皮细胞中，Myc抑制率为39%±5%（图1G-H）。接着为了阐明p53激活导致Myc抑制的机制，我们检查了p53是否与Myc位点相关。我们观察到，在Doxo处理的MEFs和tamo处理的KPR细胞中，应力依赖性的Myc抑制伴随着p53与位于Myc下游50 kb处的远端p53RE的结合（图1I）。与p53依赖相一致，p53存在的MEFs中，Myc RNA和蛋白水平的变化是存在的（图1J，1K）。此外，Myc RNA水平的降低在p53激活4h后可以检测到，与Myc蛋白水平的减少相吻合（图1L和1M）。使用Cycloheximide抑制蛋白翻译表明，压力的存在并未显著影响Myc蛋白的稳定性（图1N）。

2.Myc抑制与Pvt1b的激活相关
    考虑到lncRNAs可以顺式调控邻近基因的转录，我们检测了Pvt1是否在胁迫时起到了限制Myc表达的作用（图2A）。我们观察到经Doxo处理的MEFs中Pvt1b的诱导率为3.1±0.2倍（图2B），经Tam处理的KPR细胞中Pvt1b的诱导率为38±6倍(图2C)。为了进一步鉴定Pvt1位点产生的转录本，我们使用位于1a或1b外显子的正向引物和位于5外显子的反向引物进行RT-PCR。我们发现了广泛的选择性剪接的证据，证实了含有外显子1b的突变是由p53诱导的，而含有外显子1a的突变是组成性表达的（图2D和2E）。尽管存在剪接异质性，但初期RNA测序显示，仅通过使用外显子1b和外显子1a，应力诱导的Pvt1b与本构性表达的Pvt1a有所不同，并表现出与下游外显子类似的剪接模式（图2F）。

3.Pvt1b在Pvt1-Myc位点周围的染色质中积累
    为了深入了解Pvt1b的潜在调控功能，我们进行了单分子RNA荧光原位杂交。我们观察到Pvt1a和Pvt1b在依托泊苷（Etop）处理的MEFs中主要表现为2点或4点核模式，分别反映了细胞周期的G1期或S/ G2期（图3A）。Pvt1a和Pvt1b在经Tam处理的KPR细胞中形成较大的云团（图3B）。值得注意的是，含有Pvt1a和Pvt1b的位点与新生Myc内含子特异性信号共定位，也与新生的Pvt1转录本共定位（图3C-3F）。这些结果使我们得出结论，转录后，Pvt1a和Pvt1b保留在围绕Pvt1-Myc位点的染色质上。亚细胞分馏分析证实了这两种Pvt1变体在染色质组分中均有富集（图3G）。

4.Pvt1b RNA抑制了Myc水平
    基于Pvt1b的应力依赖性表达及其局部染色质积累，我们推测Pvt1b可能通过RNA依赖性机制参与Myc的抑制。为了直接验证这一假设，我们设计了三个针对1b外显子的独立反义寡核苷酸（ASOs）（图4A）。我们使用无目标的ASO作为阴性对照。由于ASOs会导致共转录RNA的裂解和降解，ASO1、ASO2和ASO3会显著下调Pvt1a和Pvt1b（图4B）。接下来，我们研究了Pvt1靶向ASOs对Myc表达水平的影响。在未处理的MEFs中，与CON样本相比，在ASO病例中，Myc RNA和蛋白水平没有发生显著变化， （图4C，4D）。与预期一样，使用Doxo治疗后，对照的MEFs的Myc RNA和蛋白水平显著下降。另一方面，我们发现以pvt1为靶点的ASOs完全挽救了应力诱导的Myc RNA和蛋白的下调。这些发现表明，p53对Pvt1b的转录激活是Myc在应激状态下抑制的必要条件。为了检测Pvt1b是否能充分抑制Myc，我们使用CRISPR-SAM系统激活p53缺陷细胞内源性Pvt1b的表达。我们分别设计了针对Pvt1a和Pvt1b启动子的A1和A2 dRNA-MS2（图4E）。与非靶向对照相比，使用A1的CRISPRa在不改变Pvt1b水平的情况下诱导了1.6倍的Pvt1a，而使用A2导致了20倍的Pvt1b活化（图4F）。接下来，我们检测了内源性Pvt1a和Pvt1b的激活对Myc水平的影响。p53修复后，Pvt1b的激活并没有进一步下调Myc水平，这说明Pvt1b的作用是在p53的下游（图4G）。另一方面，Pvt1b的激活不足以抑制Myc蛋白水平，这为在转录后水平独立输入Pvt1b提供了可能（4H）。然后，为了区分顺式和反式的活性，我们通过转染含有外显子1a-10（1a）或1b-10（1b）的cDNA构建物来检测外源性的Pvt1a和Pvt1b是否会影响Myc的表达（图4I）。我们观察到Pvt1a的过表达为6.5倍，而Pvt1b的过表达为23倍，与CRISPRa诱导的过表达相当（图4J）。然而，我们发现外源运输的Pvt1a或Pvt1b对Myc RNA或蛋白水平没有显著影响，这与反式运输的影响相反（图4K、4L）。

5.Pvt1b的遗传抑制逆转应力诱导的Myc下调
    为了研究Pvt1b对p53抑癌途径的功能贡献，我们开发了一种基因方法，通过改变表达所需的p53RE来特异性抑制Pvt1b的表达。我们通过Sanger测序证实了p53RE的突变，并通过染色质免疫沉淀证实了∆RE突变将p53的结合降低了15倍（图5A，5B）。通过qRT-PCR，与对照组相比，∆RE细胞中的Pvt1b水平被显著抑制（图5C），而通过smRNA-FISH，我们观察到经Tam处理的∆RE KPR细胞中Pvt1b特异性信号的丢失（图5D，5E）。这些观察使我们得出结论，Pvt1b相关的p53RE突变导致了应力依赖性Pvt1b活化的有效消除。接下来，我们通过qRT-PCR和免疫印迹法检测了∆RE突变以及由此导致的Pvt1b表达缺失对细胞应激反应中Myc水平的影响。在Con KPR群体、KPR克隆和MEF系中，暴露于致癌或基因毒性应激导致的Myc RNA和蛋白水平预期显著下降（图5F-H）。与非应激细胞相比，∆RE KPR群体、KPR克隆和MEF系暴露于应激并不导致Myc RNA水平显著下降，这与ASO数据一致。这些结果为Pvt1b调控p53下游的Myc RNA水平提供了独立的遗传验证。

6.Pvt1b抑制了Myc转录活性和细胞体外增殖
    通过分析∆RE突变对未处理、Doxo处理的∆RE和Con MEFs的总RNA的基因表达的影响，我们证实Myc是Pvt1b应对应激的调控靶点（图6A）。接下来，为了测试Pvt1b是否在转录水平或转录后水平发挥作用，我们对未处理和经Tam处理的∆RE和Con KPR细胞新生RNA进行了测序。我们发现，与Con+Tam KPR细胞相比，∆RE+Tam细胞中新生的Myc转录本显著上调（图6B，6C）。这些数据表明，Pvt1b的产生促进了Myc的转录抑制。接下来，我们通过检测196个Myc靶基因中Pvt1b缺失的后果，探讨Myc RNA水平的变化如何影响Myc转录程序。与随机产生的一组表达水平相当的对照基因相比，我们发现MEFs和KPR细胞中Myc靶点的水平显著升高（图6D，6E）。考虑到Myc靶基因包含促进细胞生长的因子，我们将突变细胞的增殖与对照组进行了比较。与对照组相比，Pvt1b表达的丢失导致细胞增殖和集落形成显著增加（图6F，6G）。这些数据表明，Pvt1b通过介导p53功能的特异性来抑制细胞的体外增殖。

7.Pvt1b的肿瘤特异性抑制促进了体内的肿瘤生长
    为了阐明Pvt1b是否在体内介导p53功能的某些方面，我们对Pvt1b相关的p53RE进行了肿瘤特异性诱变（图7A）。Sanger测序证实了在UGPC-∆RE感染动物中成功突变了pvt1b相关的p53RE（图7B）。接下来，我们检查了感染UGPC-Con、UGPC-p53KO和UGPC-∆RE病毒的小鼠肺部的HE切片，并在肿瘤发生16周后处死。组织病理学分析显示，在感染UGPC-Con的动物中，所有的肿瘤都表现出了1级特征。相比之下，70%的表达UGPC-p53KO的肿瘤以非典型核、间质增生和向低分化表型转化为特征，并被划分为2级或3级（图7C，7D）。另一方面，肿瘤面积相对于总肺面积的定量显示，UGPC-∆RE小鼠的肿瘤负荷较对照组小鼠显著增加（图7 E）。值得注意的是，p53RE编辑的小鼠的肿瘤负荷与UGPC-p53KO小鼠的肿瘤负荷相当（图7E）。这些发现表明，Pvt1b在很大程度上介导了p53下游的生长抑制功能，尤其是在疾病的癌前病变阶段。与UGPC-Con小鼠相比，感染UGPC-∆RE的动物的肿瘤负荷增加并不是由于细胞凋亡减少。相反，肿瘤负荷的增加可能是由于增殖的增强。在Pvt1b缺陷肿瘤中，来自UGPC-∆RE感染动物的肿瘤的磷酸化组蛋白H3 阳性的有丝分裂细胞明显多于来自UGPC-Con感染小鼠的肿瘤（图7F，7G）。最后，为了研究Pvt1b是下游作用还是独立于p53，我们进行了上位实验。我们分析了UGPC-Con或UGPC-∆RE病毒在肿瘤发生12周后的肿瘤负荷。与上述结果一致，我们观察到UGPC-∆RE感染小鼠与UGPC-Con感染的KC动物相比，肿瘤负荷显著增加。相反，我们发现感染UGPC-∆RE和UGPC-Con的KPC动物的肿瘤负荷没有显著差异。感染UGPC-∆RE的KC小鼠与感染UGPC-Con的KPC小鼠的肿瘤负荷差异无统计学意义（图7H）。这些结果表明，Pvt1b和p53通过一个共同 的途径增强了癌前肿瘤的扩散。

结论：
    保守的lncRNA亚型Pvt1b是一种位点特异性的转录调节因子，在p53介导的应激反应中抑制Myc的转录。Pvt1b RNA的产生抑制细胞增殖和肿瘤生长，揭示了这种癌症相关的lncRNA的肿瘤抑制活性。