circRNA综述：环状RNA在胶质瘤中的作用及临床意义

    CircRNAs是一类具有共价闭环结构的单链RNA分子，具有高度的稳定性、丰度、保守性和显示组织/发育阶段特异性表达等特点，此外，基于不同体液或外泌体中的丰度，CircRNAs为癌症的诊断和预后提供了新的生物标志物和靶点。近年来，miRNAs和RBPs海绵、翻译以及转录和剪接调控等生物发生和分子功能的调控机制逐渐被揭开，尽管许多方面仍有待结合深序列和生物信息学来阐明。越来越多的研究表明，CircRNAs在神经元组织中更加丰富，部分原因是促进环化的特异性基因的丰度较高，这表明CircRNAs的失调与包括胶质瘤在内的神经系统疾病密切相关。
    近期，一篇名为“Functions and clinical significance of circular RNAs in glioma”的综述文章在Molecular Cancer（IF=10.679）上发表，就胶质瘤的生物发生、功能、数据库以及分子通路方面的最新进展作总结，强调其作为胶质瘤诊断或治疗靶点的重要价值。

一、circRNA的生物发生和调控

图一：该代表图总结了circRNA的形成模型 a三种典型的环化形式。内含子配对驱动的环化是由顺式作用的调控元件介导的，其中包括反向互补序列(Alu重复)，从而促成侧翼内含子的直接碱基配对。套索驱动环化，内含子对的套结形成使外显子通过后向剪接跳过，形成ecircRNA或eIciRNA。反式作用因子，如RNA结合蛋白(RBPs)或几种与侧翼内含子特定序列基序结合的剪接因子，促进CircRNA的生物发生。富GU和富C元素有助于在规范剪接后产生内含子RNA。 b基因间环状RNA是由基因间的远距离区域产生的。 c 环状LINC-PINT外显子的形成。

二、环状RNA的功能

图二：CircRNA的潜在功能。CircRNA可作为miRNA海绵，调节相关靶基因的表达。CircRNA可以调节其亲本基因的转录和剪接。CircRNA可以结合几种蛋白质来介导其作用。丰富的IRES和M6A修饰可以促进多种CircRNA的翻译，尤其是GBM的丰富。CircRNAs也可以作为存在于血清和其他体液中的分子生物标记物，突出显示对包括癌症在内的疾病进行诊断和治疗的重要价值。
1. CircRNA充当miRNA海绵或竞争性内源RNA
    MiRNA介导的mRNA和相关信号通路的失调与癌症的进展和治疗抗性密切相关。CircRNA可以作为竞争性内源性RNA(ceRNAs)或miRNA海绵来抑制miRNA，从而通过MREs上调靶基因的表达(图2)。
2. 核circRNA调节转录和剪接
    环核糖核酸的加工自然影响其线性同源物的选择性剪接，并与pre-mRNA剪接竞争，这表明CircRNA与其线性异构体之间存在负相关关系。例如，CircMb1来源于MBL第二外显子的环化，它可以与线性MBL mRNA竞争，以维持典型剪接和环核糖核酸生产之间的平衡。另一种核保留的CircSEP3也被发现通过RNA：DNA杂交体或R-loop来调控其线性对应物的剪接，上述这些研究表明一些定位的核环状核糖核酸可以调节基因转录和剪接(图2)。
3. CircRNA与RBP相互作用
    CircRNAs可以与不同的蛋白质结合形成特异的CircRNA-蛋白质复合物(CircRNPs)，从而调节相关蛋白质的作用、蛋白质的亚细胞定位以及亲本或相关基因的转录(图2)。此外，CircRNAs还可以通过与翻译因子的特异性结合来调节其同源mRNA的翻译。特定的circRNA可以与不同的RBPs结合，而某些circRNA对不同的RBPs也具有动态亲和力。
4. CircRNAs 可被翻译
    circRNA的翻译在包括胶质瘤在内的人类癌细胞中可能更为普遍。CircRNA和由这些circRNA编码的肽/蛋白质在肿瘤细胞的进展和侵袭中起着重要的作用。circRNAs编码的肽的研究主要与神经胶质瘤的发生有关，这表明circRNA在神经胶质瘤的恶性进展中具有重要意义。
CircRNAs编码的多肽/蛋白通常含有不到100个氨基酸，在调节肿瘤能量代谢、EMT转移、c-Myc癌蛋白稳定性等方面发挥着重要作用。因此，这些肽/蛋白是肿瘤治疗的有希望的药物靶点或预测患者临床预后的生物标志物，特别是在GBM(图2)。
5. 其他功能
    由EML4-ALK融合基因产生的CircRNA F-CircEA可作为一种新的非小细胞肺癌液体活检生物标志物。稳定的CircRNAs可以被逆转录，并最终作为加工假基因插入宿主基因组，通过提供额外的CTCF结合位点来重塑基因组结构。CircANRIL与Peccadillo同系物1(PES1)结合，损害了核酸外切酶介导的Pre-rRNA加工和核糖体的生物发生。

三、CircRNA和神经胶质瘤
    CircRNA在神经元组织中含量更高，并且在不同的大脑区域表现出差异表达。这种现象可能归因于大量产生各种circRNA和剪接因子的蛋白编码基因，以及调节circRNA形成的RBP。
1. circRNA在神经胶质瘤中的表达
    越来越多的证据表明，CircRNAs的异常表达与胶质瘤的发生发展密切相关。共表达网络的构建表明，circRNA的改变，丰富了多种癌症相关通路，是脑癌或神经系统疾病的驱动因素。
2. CircRNA充当microRNA海绵，促进增殖和侵袭

图三：circRNA介导的ceRNA网络与癌基因信号通路的代表图。目前对胶质瘤的研究强调了circRNA-miRNA-mRNA网络对不同信号通路的调控关系。多种已鉴定的CircRNAs作为miRNA海绵发挥作用，随后上调相关靶基因的表达水平。然而，这些靶基因或蛋白通过作为转录因子或调节蛋白等机制进一步调节与癌症信号通路相关的下游因子。图中主要显示CIRC-0000177通过miR-638/FZD7激活Wnt/β-catenin途径。CircTTBK2、CircSHKBP1和CircHIPK3分别通过miR217/HNF1β、miR544a/foxp1和miR379/foxp2激活PI3K/AKT和MARK/ERK信号通路。另外，CircNPIX通过miR34a/NOTCH1激活Notch信号通路。更重要的是，包括miR-124、miR-29和miR-654等被circHIPK3海绵化的大量mirna，影响多种信号通路，提示circRNA介导的ceRNA网络通过信号通路在胶质瘤进展中发挥重要作用。
3. CircRNA通过癌症相关的信号通路影响神经胶质瘤的增殖和侵袭
    CircRNA的异常表达通过调节与癌症相关信号通路密切相关的互补miRNA或靶标mRNA，如PI3K / AK / mTOR，Wnt /β-catenin，在胶质瘤的增殖，细胞周期，侵袭和转移中起着至关重要的作用。总的来说，与癌症相关的通路与肿瘤发生、化疗和抗辐射密切相关，识别更多参与肿瘤通路的CircRNAs对于进一步了解胶质瘤的分子生物学和开发新的靶向治疗方法具有重要意义。(图3)。
4. CircRNA和血管生成
    缺氧和各种信号通路刺激肿瘤血管生成，缺氧也可以诱导circRNA的产生，而circRNA也参与了血管生成。RBPs可与CircRNA相互作用，参与肿瘤血管生成的调节。最近的一项研究提出，circSMARCA5作为海绵，作用于剪切因子丝氨酸和富含精氨酸的剪切因子1 (SRSF1)，在GBM中靶向并介导VEGFA的表达，从而表现出抗血管生成的功能(图3)。
5. CircRNAs是胶质瘤诊断和预后的潜在新型生物标志物
    CircRNAs的鉴定和功能研究表明，CircRNAs可作为癌基因或肿瘤抑制基因调控下游靶基因，具有重要的临床应用价值。与其他ncRNA相比，ncRNA除了具有独特的共价环状结构外，还有其他一些独特的特征。具体地说，1）没有5 'caps和3 'poly (A)的尾巴的结构特征使CircRNA对核酸外切酶具有抗性，半衰期大于48 h。2)大多数CircRNA的序列在不同物种间在进化上是保守的。3)CircRNA表现出细胞类型、组织类型和发育特异性表达。4)CircRNA是通过独占可变剪接产生的，并且在真核细胞的细胞质中大量存在。5)CircRNA在真核细胞的胞浆中大量存在。7)CircRNAs含量丰富，广泛富集在外切体中。从临床角度来看，CircRNA被证实广泛存在于血液和液体(唾液、尿液、滑液)中。因此，这些特性促使CircRNAs成为胶质瘤诊断、预后和疗效评价的有价值的生物标志物。细胞外小泡(EVs、外泌体和微泡)通过将分子运输到周围环境中，从而改变或重新编程肿瘤微环境，在细胞间通讯中发挥关键作用。它们含有各种分子的载体，如蛋白质/肽、mRNA、非编码RNA和DNA，这些分子决定了它们在肿瘤进展、代谢调节、免疫调节、血管生成和治疗耐药中的作用。此外，由于它们的高度稳定性和特异的差异表达模式，它们被认为是很有前途的癌症生物标记物。（表1）

    目前，miRNA通过调节特异性靶基因来调节TMZ敏感性已得到广泛验证。所有相关研究都将使CircRNA成为有希望的诊断/预后生物标志物和新的治疗靶点。
6. CircRNA和神经胶质瘤的免疫治疗
    PD-1/PD-L1检查点阻断是几种肿瘤(包括胶质瘤)的一种很有前途的靶向策略。然而，基于胶质母细胞瘤的低免疫原性和免疫抑制微环境，尽管PD-L1上调是胶质母细胞瘤细胞免疫治疗的预后生物标志物，但针对PD-1/PD-L1检查点的效率低下主要归因于肿瘤的TME，如各种基因组亚型或分子谱。因此，迫切需要RT、TMZ、抗体联合检查点阻断免疫治疗。miRNAs与肿瘤免疫的关系是明确的，而CircRNA与抗肿瘤免疫密切相关。根据与miRNAs、蛋白结合的理论，肿瘤外体中的CircRNA可作为肿瘤抗原激活抗肿瘤免疫，是潜在的免疫治疗靶点。这些不同的理论是预测性的，CircRNA-miRNA-mRNA和其他可用的RBPs对胶质瘤免疫调节的调节机制还很薄弱，值得全面和深入的探讨。

四、研究策略与鉴定
    高通量RNA-seq和芯片分析促进了CircRNAs的检测。生物信息学社区迅速发展了CircRNA探索过程，即从处理映射阅读的自定义脚本到生产完整的工作流。实验验证是继计算预测之后进一步研究CircRNAs功能的基础。利用位于BSJ位点两侧的发散引物进行QRT-PCR，证实在互补DNA(CDNA)中扩增出环状DNA，而在基因组DNA(GDNA)中没有扩增出环状DNA，而Sanger测序证实了连接位点的存在。基因的敲除和过表达同样应用于CircRNAs功能的研究。通过反向剪接位点与同源线性RNA互补的小干扰RNA或短发夹状RNA对线性核糖核酸的表达有潜在的影响，说明应进行严格控制的小干扰RNA半序列(∼10 NT)替换。

五、circRNA的数据库
    为了促进circRNA研究的分析，已经有数个数据库来提供巨大的有价值的信息。