又一调控轴被发现啦？！CircFBXW4/miR-18b-3p/FBXW4抑制肝纤维化

    CircRNA在多种疾病中发挥着重要的调控作用，但circRNA在肝纤维化（HF）中的表达谱和功能仍未解决，本文在一定程度上回答了此问题，并在2020年3月26发表于《Theransotics》杂志上。
本文主要结果如下：
1、HSCs小鼠的circRNA的表达谱
    为了研究参与HF的circRNA的表达谱，使用RNA- Seq分析了原代肝星状细胞（HSC）三个阶段的（媒介期，HF进展期和HF消退期）表达谱。图1A是动物处理的示意图，图1B表明小鼠三个时期的病理特征符合预期，肝纤维化和损伤期小鼠HF加重，而HF恢复后减轻。图1C-D显示纤维发生因子的表达量在HF小鼠的HSC中持续高表达而在HF恢复的小鼠中则下降。此外，共鉴定4343个差异表达的circRNA。

                                              图1 HSCs小鼠的circRNA的表达谱
2、CircFBXW4的表达在HF的小鼠中下降，在HF恢复的小鼠体内表达恢复
    尽管根据表达丰度和外显子的类型筛选到27个差异表达的circRNA，其中在肝纤维组上调的11个和下调的16个。PCR验证后只有8个的表达与RNA测序一致（图2A），其中与媒介期相比，circFBXW4在HF中显著下调表达。因此，作者选定它为下一步研究对象。此外，小鼠的肝脏急性损伤模型的研究中发现circFBXW4的表达显著下调（图2B-D）。circFBXW4的表达在肝纤维时下降在HF恢复处理后表达上调（图2E），且circFBXW4的宿主基因FBXW4的表达呈现出一致的趋势（图2G）。此外，人体中的研究结果与小鼠体内类似，与健康对照组相比，人纤维化肝组织中circFBXW4的水平下调（图2I-J）。总之，这些结果揭示了HF进展中circFBXW4的下调，而HF恢复中circFBXW4的表达恢复（图2H）。 表明circFBXW4的表达与HF病理相关，并且circFBXW4可作为HF的诊断和预后标志物。

                                    图2 CircFBXW4的表达在HF的小鼠中下降，在HF恢复的小鼠体内表达恢复
3、CircFBXW4的表征
    circFBXW4来源于宿主基因FBXW4，定位于19号染色体，包含4个外显子，实验证实其头尾连接位点，且不可被Rnase R消化，核定位显示主要分布于细胞质中（图3）。

                                                 图3 CircFBXW4的表征
4、circFBXW4在体外抑制LX-2细胞的活化和增殖
    过表达circFBXW4降低了FBXW4，TGF-β1，TIMP-1，α-SMA和collagens I的mRNA水平以及α-SMA和collagens I的蛋白水平（图4A-B），并抑制了LX-2细胞的活化，细胞增殖，DNA合成和凋亡（图4C-G）。

                                       图4 LK-2细胞中过表达circFBXW4对其活性，增殖和凋亡的影响
5、circFBXW4对HF小鼠的抗纤维化作用
    施用荧光素酶标记的pHBAAV-circFBXW4后，HF小鼠的肝实质和血管结构畸变，胶原蛋白沉积和α-SMA+成纤维细胞免疫信号持续降低（图5C），这与HSC中α-SMA和胶原蛋白I的表达降低有关（图5D）；此外，肝组织中的羟脯氨酸（HYP）水平和血清中的丙氨酸转氨酶（ALT）均降低（图5E-F）。此外，circFBXW4过表达后，纤维化因子（TGF-β1，α-SMA，胶原蛋白I和TIMP-1）下调（图5G）。
    综上这些结果表明，通过递送肝特异性pHBAAV-circFBXW4，在具有FBFBXW4过表达的HF小鼠中，肝纤维化损伤和肝纤维化标志物的表达被显着抑制。

                                             图5 HF小鼠体内circFBXW4的抗纤维化效果
6、circFBXW4在体内可预防HF小鼠的炎症反应
    炎症反应对HSCs激活和HF的启动具有重要作用，因此，评估了circFBXW4在肝纤维化中对炎症反应的功能。与媒介物相比，HF小鼠的肝巨噬细胞中circFBXW4的水平变化可忽略不计，并且在施用pHBAAV-circFBXW4后，肝巨噬细胞中circFBXW4的水平显着升高（图6A-B）。在circFBXW4过表达后，促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的循环水平降低了（图6C）。此外，C-C基序趋化因子配体2（CCL2）和CCL9的mRNA水平在用pHBAAV-circFBXW4处理的肝巨噬细胞中得到抑制（图6D）。
    作者使用炎症抗体进一步测试了40种炎症因子在小鼠肝组织裂解物中的表达数组。结果显示，与媒介组相比HF小鼠的五种炎性因子的水平有所增加，而circFBXW4过表达后水平又下降了（图6E）。另外，在递送pHBAAV-circFBXW4后，肝脏组织中F4 / 80的免疫染色持续降低，HF小鼠中F4 / 80 + CD11b +肝巨噬细胞（肝巨噬细胞和浸润性单核细胞）也持续下降（图6F-G）。

                                              图6 HF小鼠体内circFBXW4的抗炎性
7、微阵列分析和鉴定circFBXW4-miR-18b-3p的相关性
    鉴于circRNA吸附miRNA的特性，使用微阵列分析了HSCs细胞中的miRNA表达谱，共检测到1881个差异表达的miRNA，其中132个miRNA在HF组和媒介组间差异表达，160个在HF组和HF恢复组间差异表达。其中有41个被预测为circFBXW4潜在靶标。
    萤光素酶结果显示与对照相比，circFBXW4-wt荧光素酶活性在6种miRNA组中显著抑制（图7D）。随后，RNA下拉检测表明miR-18b-3p，miR-324-3p和miR-18b-5p可能直接与circFBXW4结合（图7E），并在circFBXW4中鉴定到miR-18b-3p的结合位点序列（图7F），circFBXW4和miR-18b-3p主要共定位在细胞质中（图7G）。此外，与载体相比，HF小鼠中miR-18b-3p的水平显着增加（图7H）。 有趣的是，施用pHBAAV-circFBXW4后，肝纤维化中更高水平的miR-18b-3p被抑制。因此，circFBXW4可能直接充当miR-18b-3p的海绵，调节HF中miR-18b-3p的水平（图7H）。因此，重点放在circFBXW4与miR-18b-3p之间的相互作用上，进行进一步研究。

                                           图7 HSC和circFBXW4结合miR-18b-3p的微阵列分析
8、circFBXW4通过海绵吸附miR-18b-3p上调FBXW4的表达
    为了挖掘与HF相关的circFBXW4/miR-18b-3p的靶基因，进行了全转录测序，获得差异表达的mRNA（DEM），对DEM进行GO和KEGG富集分析（图8A-D）。分析发现FBXW7是miR-18b-3p的一个潜在靶基因，其结合序列如图8E所示。此外，作者发现，HF小鼠中无论是CCl4诱导还是BDL处理FBXW7的表达始终下调。
    进一步揭示，circFBXW4通过海绵吸附miR-18b-3p调节FBXW7发挥抗纤维化作用，但是，miR-18b-3p水平上调后，pHBAAVcircFBXW4处理对FBXW7的作用被逆转（图8G-I）。相反，FBXW7的下游Yap1与指定的治疗相反（图8G-I）。这些结果表明circFBXW4充当了miR-18b-3p的海绵通过circFBXW4 / miR-18b-3p / FBXW7轴消除对HF的影响。

                                            图8 circFBXW4/miR-18b-3p/FBXW7轴的鉴定
    总之，这篇研究揭示了HF中的circFBXW4 / miR-18b-3p / FBXW7形成的新型调控轴。研究了circFBXW4在HF中的表达模式，功能和机制，证实了在HF消退阶段挽救了circFBXW4的表达，但该机制尚未明确阐明，需要进一步验证。此外，circFBXW4提供了一个平台，可容纳各种与肝脏或纤维化相关的miRNA候选基因，但circFBXW4在ceRNA机制中的参与机制仍需解决。
参考文献：
Chen Xin., Li Hai-Di., Bu Fang-Tian., Li Xiao-Feng., Chen Yu., Zhu Sai., Wang Jia-Nan., Chen Si-Yu., Sun Ying-Yin., Pan Xue-Yin., Yin Na-Na., Xu Jie-Jie., Huang Cheng., Li Jun.(2020). Circular RNA circFBXW4 suppresses hepatic fibrosis via targeting the miR-18b-3p/FBXW7 axis. Theranostics, 10(11), 4851-4870. doi:10.7150/thno.42423