circRNA促进肝癌干细胞自我更新

    随着高通量RNA测序的发展和新颖的计算方法，在真核生物中已发现大量内源的、保守的、稳定的和特异性的环状RNA（circRNA）。癌症干细胞（CSC）具有自我更新潜力，与肿瘤的发生、发展和转移密切相关。然而，尚不清楚在癌症中circRNA如何调控CSC 。今日，小编带大家一探其奥秘。

技术路线：

结 果：
1. Circ-MALAT1在肝CSCs中高表达
    患者实体瘤中获得肝细胞癌的原代细胞（HCC）和CSC，进行circRNA-seq，发现共有193个circRNA在肝细胞CSC中异常表达，其中两个被下调，十八个包括MALAT1在内的circRNA鉴定为异位表达。使用聚合引物和发散引物确认发现的circRNA确实是首尾相连环状结构，九种候选circRNA对RNase R具有抗性，进一步验证circRNA的环状封闭结构。9个中MALAT1呈现出更高的CSCs中的表达水平。

2. Circ-MALAT1促进肝细胞CSCs的自我更新
    与circ-MALAT1侧翼结合的剪接相关因子中，AUF1 mRNA在CSC中表达上调，AUF1蛋白与MALAT1前端绑定，Huh7细胞沉默AUF1降低了circ-MALAT1的表达。circ-SPARC在CSC与匹配的临近细胞之间无差异，作为阴性对照。HCC细胞过表达circ-MALAT1形成更多悬浮球，体内注射的circ-MALAT1过表达细胞导致更大生长更快的肿瘤。这些表明，circ-MALAT1在AUF1的协调下在HCC中促进了CSC进行自我更新。

3.Circ-MALAT1的表达导致JAK2和PAX5的差异表达
    蛋白阵列显示MALAT1过表达后224个蛋白质上调和43个蛋白质下调，GO分析有96个上调蛋白参与CSCs自我更新或肿瘤转移和增殖。在三个最显着富集GO中，选择五个倍数变化最大的蛋白（FGF2，TGFB1，PTK2，JAK2和GH1）作进一步研究。在43种下调的蛋白中，有10种参与肿瘤抑制。HCC细胞过表达circ-MALAT1后Janus激活激酶2（JAK2）蛋白增加，PAX5下调明显。敲低circ-MALAT1后结果相反。此外，Huh7细胞circ-MALAT1过表达产生的异种移植肿瘤表现出较高的JAK2和较低的PAX5蛋白表达。这些结果表明circ-MALAT1可能导致肝细胞CSC中JAK2上调和PAX5的下调。

4. Circ-MALAT1通过与PAX5编码序列和核糖体结合而阻碍PAX5的翻译
    荧光原位杂交发现circ-MALAT1是位于细胞质，过表达circ-MALAT1后PAX5 mRNA的表达无变化，这表明circ-MALAT1可能在转录后水平发挥其调节作用。MALAT1和PAX5可与核糖体结合，裂解转染circ-MALAT1 IRES突变质粒的Huh7细胞进行RIP分析，来自circ-MALAT1 IRES2突变样品的抗rps6 RIP产物的数量比IgG对照增加了2- 3倍，而IRES1突变则没有差异，表明共识IRES1和IRES2的序列（位置640–755）为circ-MALAT1与核糖体结合所必需。生物素标记的PAX5 mRNA特异性探针进行体内RNA下拉实验，Huh7中PAX5 mRNA的富集水平都相当，circ-MALAT1的富集倍数在突变体远低于那些在WT中，表明11个碱基对于circ-MALAT1结合PAX5 mRNA至关重要。circ-MALAT1过表达的细胞中PAX5蛋白及其下游蛋白p53的表达下调，PAX5和p53在CSC中被下调。转染WT circ-MALAT1的细胞中，只有PAX5蛋白表达明显下调，而转染了circ-MALAT1 ires2突变体的细胞中，PAX5蛋白表达轻微下调。

5. Circ-MALAT1作为miR-6887-3p海绵上调JAK2
    筛选预测出121个靶向JAK2的miRNA，circ-MALAT1过表达miR-6887-3p表达降低，下拉实验表明circ-MALAT1特异探针可有效拉低circ-MALAT1，miR-6887-3p也显著富集。miR-6887-3p模仿物处理的Huh7细胞不影响JAK2 mRNA水平，但JAK2蛋白减少。表明miR-6887-3p可以在转录后水平抑制JAK2表达。pMIR-JAK2-3’UTR WT的萤光素酶活性可以被miR-6887-3p模拟有效抑制。circ-MALAT1的过表达减弱miR-6887-3p的JAK2抑制作用，从而增加了JAK2和其磷酸化水平，促进STAT3的磷酸化和激活，JAK2 / STAT3信号通路中的三大关键蛋白分子JAK2，磷酸JAK2（p-JAK2）和磷酸STAT3（p-STAT3）在CSC中被上调。

6. Circ-MALAT1在体内吸附miR-6887-3p上调JAK2
    为了进一步验证miR-6887-3p在体内的特异性，在异种移植肿瘤中用miRNA模拟物或抑制剂进行治疗，miR-6887-3p模拟物不影响JAK2 mRNA和circ-MALAT1的表达，JAK2蛋白显著降低，用miR-6887-3p抑制剂治疗又相反趋势。另外，由于MALAT1减弱了miR-6887-3p对JAK2蛋白的抑制作用，p-JAK2表达增加。以上表明，CSC中的circ-MALAT1上调可以吸附miR-6887-3p，增强JAK2 / STAT3途径活性促进肝细胞CSC自我更新能力。

7. circ-MALAT1同时作为mRNA翻译制动器和miRNA海绵促进肝细胞CSCs自我更新