CircTLK1，肾细胞癌新的预后标志物和治疗靶点？

    circRNA主要存在于细胞质或外泌体中，具有组织特异性、疾病特异性、时序特异性及高稳定性等特征。大量研究表明circRNA通过调控细胞生长、分化、迁移、侵袭以及调亡等多种生物学过程参与了癌症的发展，并预测了其在疾病诊断和治疗标志物等方面的应用前景。目前对circRNA的生物学功能和调控机制还知之甚少。近期北京大学深圳医院泌尿研究所的桂耀庭团队描述circTLK1在肾癌细胞（RCC）中的表达特征，并分析和阐述了其与miR-136-5p/CBX4的ceRNA调控机制如何影响RCC细胞的增殖、迁移、侵袭以及转移的。该研究表明circTLK1可能成为RCC的预后标志物和治疗靶点。相关研究结果以“CircTLK1 promotes the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by sponging miR-136-5p”为题发表在Molecular Cancer杂志上，杂志影响因子15.302。
背 景：
    大量研究证明circRNA是肿瘤发生和进展的可能生物标记物和重要的调控因子。然而circRNA在RCC中的作用很大程度上仍然是未知的。
材 料：
    RCC组织和正常肾组织，人RCC细胞系，人肾上皮细胞细胞系，小鼠动物模型。
方 法：
    circRNA-seq，shRNA，RNase R实验，CCK-8 assay，colony-formation assay，细胞划痕实验， transwell，FISH，RNA pull-down，荧光素酶报告基因实验，WB，免疫荧光，免疫组化。
结 果：
    发现circTLK1在RCC中表达上调，其表达与远处转移和不良预后呈正相关。circTLK1沉默可显著抑制RCC在体内外的增殖、迁移和侵袭。circTLK1主要分布在细胞质中，作为miR-136-5p的海绵正向调控CBX4表达。CBX4过表达能逆转circTLK1沉默诱导的RCC细胞表型抑制。因此，circTLK1通过作为miR-136-5p的海绵调控CBX4表达的方式在RCC发展中起重要作用。
研究思路：

1.筛选和鉴定RCC中高表达的circRNA
    circRNA已被证明在肿瘤发生、发展过程中有重要作用。作者通过RNA-seq筛选了在RCC细胞中与正常肾上皮组织细胞高度差异表达的circRNA（a）。通过生信分析和qPCR验证发现circTLK1在RCC细胞中上调最明显，在RCC组织和术后转移的RCC病人中高表达，并与RCC患者总生存率和无进展生存率呈负相关（b-e）。Sanger鉴定和RNase R实验验证了circTLK1的环状结构（g,i）。

2.circTLK1敲除抑制RCC细胞的增殖、迁移和侵袭
    确定circTLK1的表达特征和结构后，接下来探究circTLK1在RCC细胞中的具体作用。利用ShRNA抑制circTLK1在RCC细胞系中的表达，发现并不改变TLK1的表达（a-c）；CCK8和克隆形成实验验证RCC细胞的增殖受到抑制（d-f）。

    利用细胞划痕实验和transwell发现在circTLK1敲除后，RCC细胞的迁移和侵袭受到抑制（a-d）。说明circTLK1参与RCC细胞的增殖、迁移和侵袭过程。

3.circTLK1的海绵基因鉴定
    细胞定位决定基因的功能方向，利用FISH和核质分离PCR确定circTLK1定位于细胞质（a-b），推测它可能是作为miRNA的海绵发挥功能。通过生物信息学分析筛选5个可能结合的miRNA，利用RNA pull-down和荧光素酶报告实验确定与circTLK1结合的miRNA是miR-136-5p（c-f），且敲除和过表达实验验证circTLK1和miR-136-5p互不改变彼此的表达（f-j），说明circTLK1对miR-136-5p具有海绵的作用。

4.miR-136-5p的下游靶基因CBX4的鉴定以及CBX4对RCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响
    通过生物信息学筛选了miR-136-5p可能的靶基因（a），其中CBX4的表达与miR-136-5p呈负相关（b）。荧光素酶报告基因实验验证与miR-136-5p结合的是CBX4 （c-d），且miR-136-5p过表达抑制CBX4的表达（e-g）。此外，CBX4在RCC组织中表达是上调的，并与肿瘤大小、术后转移呈正相关，与RCC患者总生存率呈负相关（h-k）。

    敲除CBX4（a），通过CCK-8、克隆形成、细胞划痕、transwell等实验验证了CBX4沉默抑制了RCC细胞的增殖、迁移和侵袭（b-i），同时发现CBX4的敲除抑制VEGFA的表达（j-K）。说明CBX4是miR-136-5p的靶基因，并参与调控RCC细胞的增殖、迁移和侵袭过程。

5.过表达CBX4可逆转circTLK1沉默导致的细胞增殖和转移抑制的影响
    为了研究CBX4与circTLK1的相互作用，作者敲除circTLK1，WB检测发现CBX4的表达显著性被抑制（a,b），过表达CBX4，发现其可以逆转circTLK1沉默诱导的RCC细胞增殖、迁移和侵袭抑制作用（c-K）。证明circTLK1/miR-136-5p/CBX4之间存在ceRNA调控机制，该机制参与调控RCC细胞增殖、迁移和侵袭过程。

6.circTLK1敲除抑制小鼠模型中RCC细胞的生长和转移
    为了探究circTLK1在体内对RCC细胞生长和转移的作用，构建了shcircTLK1和shNC异种移植肿瘤和肺转移小鼠模型。研究发现，circTLK1敲除显著性减少肿瘤的体积和重量（a-c），同时抑制了CBX4和VEGFA的表达（d-e）。肺转移模型中，circTLK1沉默显著减弱了肺部肿瘤转移（f-h）。同时，在肿瘤模型中过表达CBX4可以逆转circTLK1沉默诱导的RCC细胞生长抑制（i）。证明circTLK1/miR-136-5p/CBX4/VEGFA调控机制可能在促进体内RCC细胞的生长和转移过程中有重要的作用。

7. circTLK1/miR-136-5p/CBX4/VEGFA调控机制图

参考文献：
    Jianfa Li, Chenchen Huang, Yifan Zou et al. CircTLK1 promotes the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by sponging miR-136-5p. Mol Cancer. 2020; 19(103).