小体积大能量：粪便微生物改善脊髓损伤
脊髓损伤（Spinal cord injury, SCI）患者表现出肠道菌群紊乱，而肠道失调加重SCI模型中的神经损伤。大量数据支持肠道微生物组在SCI中发挥重要作用。本文作者推测：来源于健康未损伤小鼠的粪便微生物移植至SCI小鼠可以发挥神经保护作用改善SCI。本研究于2021年3月发表在《Microbiome》IF: 11.607期刊。
技术路线：
本文主要实验结果如下：
为了探究肠道微生物群对SCI的影响，将健康未损伤小鼠来源的FMT转移至SCI损伤小鼠中（图1a）。在用抗生素取出微生物后，小鼠随机分为4组：sham, sham+FMT, SCI, SCI+FMT。结果表明，与SCI组比较，在FMT处理14天后即显著提高了后肢的运动功能，并且提高了开放运动（BMS）得分和BMS亚得分（图1b, c）；FMT处理后站立阶段的行走时间百分比显著减少(图1d)。此外，步幅长度增加，步幅频率降低，而FMT处理逆转了这一趋势(图1e, f)。FMT能在一定程度上改善脊髓损伤所致的步态异常，增强步态的协调性。SCI小鼠的握力在损伤后逐渐持续恢复。损伤后7天，14天，和21天，SCI组与FMT组的握力无明显差异。仅在损伤后28 天时，与SCI组相比，FMT组表现出了具有统计学意义的改善(图1g)。总之，与未接受FMT治疗的受伤小鼠相比，接受FMT治疗的小鼠表现出相对更大的运动恢复。
图1 FMT治疗对运动恢复的影响
2. FMT处理可以促进下行运动通路的恢复
随后，为了检测运动皮质到后肢运动神经元的下行通路的功能，在伤后4周记录了运动诱发电位(MEPs)（图2）。MEPs，反应神经肌肉单元连通性的，电刺激运动皮层后，记录肠道肌肉的MEPs（图2a）。在Sham组和Sham+FMT组，检测到典型的MEPs波形。受伤后，MEPs大多被消除，表明神经肌肉单元的破坏。与未使用FMT治疗的SCI小鼠相比，使用FMT治疗的SCI小鼠表现出更大的振幅(图2b)。不同组的振幅量化如图2c所示。此外，SCI小鼠MEP潜伏期(至17.8 ms)明显高于Sham组(4.63 ms)。SCI与SCI+FMT组MEP潜伏期无显著差异(图2d)。这些观察结果表明，FMT治疗是有益的，并可能进一步促进脊髓损伤后的功能恢复。
图2 FMT治疗对脊髓传导能力的影响
3. FMT处理促进神经元存活和突触重建
为了探究所观察到的运动恢复的解剖学基础，我们对脊髓切片进行免疫荧光染色（图3）。在sham组，前角神经元表现正常，胞体大，轴突完整。SCI导致NeuN阳性神经元显著丧失。然而，与SCI组相比，FMT组的Neun阳性细胞数量显著增加(图3a, b)。突触蛋白(SYN)是一种标记突触前膜的囊泡蛋白。免疫染色分析显示损伤后4周SCI组突触蛋白染色降低，经FMT处理后突触蛋白染色强度增加(图3 b, d)。神经丝(NF-200)是神经元轴突中富含的细胞特异性蛋白，其染色已被应用于评估神经元和轴突损伤。与SCI组相比，损伤后4周，FMT处理后病变区NF-200染色增加(图3b, e)。数据表明，FMT处理可能促进了创伤性脊髓损伤后神经元的存活和轴突再生。
图4 FMT治疗对脊髓损伤后神经元存活和突触再生的影响
在指定的时间点监测并比较体重。与SCI组相比，SCI + FMT组体重增加更多，在术后14，21，和28天均表现出显著差异（图4a）。与这些结果相一致的是，与SCI组比较，在SCI +FMT组中观察到食物摄入量和水消耗量的增加，特别是在损伤后第28天(图4b, c)。间接量热法测定平均呼吸交换商（RQ值）在SCI + FMT组恢复正常(图4 d, e)。如图4f, g所示，在脊髓损伤动物中，FMT治疗也显著提高了平均能量消耗。这些结果证实SCI后的FMT处理导致更多食物和水的消耗，更高的能力消耗，和更大的体重增加。
图4 FMT治疗对体重、食物摄入、水消耗和新陈代谢的影响
5. FMT处理有利于维持SCI小鼠肠道屏障的完整性
改变肠道屏障完整性和随后的胃肠道功能障碍被认为是SCI的病理生理事件。为了测试是否FMT处理对脊髓损伤后小鼠肠道屏障通透性有影响，在损伤后第4周测定FITC标记的葡聚糖(4kd)和血液中FITC水平。与SCI + FMT小鼠相比，SCI小鼠结肠通透性更严重(图5a)。肠道紧密连接已被证明与肠道屏障完整性有关。如图5b、c所示，ZO-1和occludin表明结肠表面的破坏和无序增加，FMT治疗稳定了紧密连接结构，这可以从ZO-1和occludin的平滑和有组织定位得到证明(图5b)。结果表明，FMT处理导致紧密连接蛋白表达上调并促进SCI后的肠道屏障完整性的维持。
图5 FMT处理对肠通透性和紧密连接蛋白表达的影响
6. FMT处理加速SCI小鼠的胃肠道消化
胃肠道消化，是整体评估肠道活力的，用钡剂灌胃后再用x射线成像对小鼠进行评估。不同组在不同时间点的代表性图像如图6a所示(2、3、8 h)。总的来说，SCI小鼠表现出更高水平的胃肠道充盈，表明胃肠道运输较慢，而FMT处理加速了小鼠损伤后胃肠道转运(图6a)。在结肠充盈和活力方面，在SCI后显著降低，但在某些时间点在SCI + FMT组得到改善(图6 a, b)。形态学分析表明，SCI损伤导致结肠填充增加，但被FMT处理逆转(图6 a、c)。总的来说，FMT处理可能导致SCI后胃肠道消化活力变快。
图6 FMT对SCI小鼠胃肠运动的影响
7. FMT处理调节SCI小鼠的肠道微生物组成
为了检测FMT是否调节肠道微生物组，进行了16S rDNA测序以分析微生物治疗SCI小鼠后的细菌分类组成。如图7a、b所示，sham组与SCI组的ace、chao指数存在显著差异，说明SCI对抗生素治疗后的再定殖过程中微生物群的丰富度有显著影响，这一观察结果与我们之前发表的脊髓损伤患者与健康对照组的临床数据一致。FMT处理显著增加了SCI小鼠肠道菌群的丰富度。热图显示，在门水平上，各组的相对丰度存在显著差异(图7c)。与Sham组相比，SCI组Firmicutes厚壁菌门相对丰度降低，而FMT处理逆转了这一趋势。相比之下，在SCI小鼠中拟杆菌门的相对丰度与SCI小鼠没有差异(图7c)。ANCOM模型对每个分类单元的分析表明SCI处理显著降低了Firmicutes门的Christensenellaceae and Lactobacillus的丰度；FMT处理显著增加了Christensenellaceae的丰度，但是对Lactobacillus的影响很小（图7d）。Bacteroidetes门的Butyricimonas, Muribaculaceae, and Bacteroides的丰度在sham组和SCI组间显著改变；FMT处理显著增加了SCI小鼠的Butyricimonas的丰度（图7d）。总之，这些结果表明FMT处理可以调节SCI小鼠的微生物群组成以改善肠道微生物失调。
图7 FMT处理对脊髓损伤后肠道细菌组成的影响
8. FMT处理可恢复SCI小鼠中粪便短链脂肪酸(SCFAs)
肠道微生物发酵的某些最终产物可进入血液，影响宿主中枢神经系统的生理功能。在调控微生物群系肠-脑轴的潜在因子中，微生物代谢产物短链脂肪酸（SCFAs）可能是主要的中介因子。检测了不同组粪便中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸等短链脂肪酸的浓度。检测的粪便短链脂肪酸中，丁酸含量变化最大， SCI组与sham组比较减少了58.6%。与SCI小鼠相比，FMT上调了粪便丁酸水平46.7%(图8b)。与丁酸类似，与sham组比较，SCI小鼠体内丙酸和异丁酸含量也分别下降了21.2%和39.4%，而FMT处理后，SCI小鼠粪便丙酸和异丁酸水平分别显著提高了21.3%和65.0%(图8a、c)。SCI小鼠的己酸减少了31.8%，但FMT治疗并没有显著改变己酸的数量(图8d)。此外，没有发现乙酸、戊酸和异戊酸的显著变化(表S1)。这些数据表明，FMT治疗可能通过改变粪便短链脂肪酸介导宿主的病理生理变化。
图8 FMT治疗对小鼠粪便短链脂肪酸水平的影响
9. 短链脂肪酸与运动恢复/肠屏障通透性的相关性
接下来，评估了丙酸、丁酸和异丁酸的含量是否与运动恢复或肠道完整性相关。多变量方差分析(MANOVA)以各组为自变量，运动预后(BMS评分和BMS亚得分)、肠道渗透率(FITC -葡聚糖)和代谢产物水平(丁酸、丙酸和异丁酸)为因变量。如图9所示，丙酸含量与BMS得分及BMS亚得分呈正相关；丁酸数量与BMS分数和BMS子分数的相关性也得到了类似的结果。丁酸含量与荧光素标记葡聚糖的渗透性呈负相关关系。此外，异丁酸含量与BMS得分呈正相关。异丁酸含量与BMS评分/ FITC -葡聚糖渗透性之间的相关性无统计学意义。因此，某些短链脂肪酸的含量对SCI后的功能恢复和屏障完整性具有一定的预测能力。
图9 SCFAs与BMS评分/BMS亚评分/ FITC -葡聚糖通透性之间的相关性
10. FMT可能通过抑制IL-1β/ NF-κB信号通路来缓解神经炎症
为了进一步探讨SCI肠道微生物失调与神经炎症之间的分子相互作用，应用免疫组化和WB分析了TNFα、IL-1β和NF-κB的在脊髓中的表达(图10a, b)。从图10c可以看出，TNFα的表达在不同组间无明显变化。同时，脊髓损伤4周后，小鼠脊髓组织中IL-1β和NF-κ b阳性表达显著增加。此外，FMT治疗降低IL-1β和NF-κB阳性染色（图10a）。WB结果显示，FMT处理明显降低了损伤后IL-1β和NF-κB的表达(图10d, e)，而对TNFα的表达无明显改变(图10c)，这与免疫染色结果一致。
图10 FMT治疗对脊髓TNF α、IL-1β、NF-κB表达的影响
11. FMT可能通过抑制NF -κB信号通路来缓解肠道炎症
作者还调查了炎症是否与肠道有关。免疫组织学染色显示TNFα、IL-1β和NF- κ b阳性染色主要分布在结肠黏膜层。WB结果显示，结肠中炎症分子的相对表达似乎低于脊髓中的。图11显示，组织染色(图11a)和WB(图11b-d)显示，TNFα和IL-1β的表达在各组间无显著差异，然而，与sham组比较，SCI小鼠结肠中NF -κB的表达上调，SCI + FMT组的小鼠表现出NF –κB表达下调，与SCI组相比(图11 a, b, e)。这些结果表明，NF -κB信号通路参与肠道炎症和神经炎症。最近的研究表明，短链脂肪酸在神经退行性疾病中发挥抗炎和神经保护作用。FMT可能改变SCFA表达谱，减轻肠道炎症和神经炎症。
图11 FMT治疗对结肠TNF α、IL-1β、NF-κB表达的影响
FMT治疗促进了小鼠脊髓功能恢复，促进了神经元轴突再生，改善了动物体重增加和代谢特征，并增强了肠道屏障完整性和胃肠道运动。此外，FMT处理显著改变了肠道菌群组成和粪便短链脂肪酸的数量。此外，FMT还下调了脊髓IL-1β/NFκb信号通路和肠道NF-κB信号通路。这些数据表明，FMT对肠道菌群的重编程改善了SCI小鼠的运动功能和肠道功能，可能是通过短链脂肪酸的抗炎作用。