机制研究套路-circNDUFB2抑制非小细胞肺癌进展

导语：环状RNA（circRNA）是一类共价闭合的单链RNA，与癌症进展有关。肺癌是最常诊断的癌症之一，也是大多数国家癌症死亡的主要原因。非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌病例的85%。CircRNA在NSCLC发生、发展中诱导免疫反应的行为和机制尚未见报道。
参考文献：circNDUFB2 inhibits non-small cell lung cancer progression via destabilizing IGF2BPs and activating anti-tumor immunity （IF=12.121）

技术路线：

结果：

1. NSCLC中circNDUFB2下调

微阵列芯片分析NSCLC样本中circRNA表达谱，共鉴定出109个失调circRNA，其中33个上调，76个下调，qRT-PCR证实来源于NDUFB2的hsa_circ_0007518，命名为circNDUFB2，下调最显著。circNDUFB2的高表达与NSCLC患者的肿瘤大小、淋巴结转移和分期呈负相关。引物扩增+Sanger测序确认circNDUFB2由NDUFB2基因外显子2-3生成，RNase R核酸外切酶消化的抗性证实circNDUFB2含有闭环结构，放线菌素D处理显示circNDUFB2稳定，核质分离以及荧光原位杂交(FISH)显示circNDUFB2主要定位于细胞质。

2. circNDUFB2抑制NSCLC进展

体外实验证实circNDUFB2过表达显著抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，circNDUFB2敲低促进这些表型。体内实验显示circNDUFB2过表达可抑制NSCLC细胞的致瘤性和转移。这些表明，circNDUFB2可能在NSCLC的进展中起抑制作用。

3. circNDUFB2与IGF2BPs相互作用，促进泛素/蛋白酶体介导的IGF2BPs降解

为检测circNDUFB2是否作为miRNA海绵调节NSCLC的靶标，进行RIP检测。FLAG抗体显著富集ciRS-7（一种与AGO2结合的circRNA），但未富集circNDUFB2，表明circNDUFB2可能在NSCLC进展中不作为miRNA海绵发挥作用。RNA pull-down实验探索circNDUFB2是否通过与蛋白质相互作用发挥功能，circNDUFB2的正义探针可高效、特异地富集circNDUFB2，质谱分析前三个丰富的蛋白分别是IGF2BP2、IGF2BP1和IGF2BP3。免疫荧光发现circNDUFB2与IGF2BPs在细胞质共定位。突变circNDUFB2结合区域显著降低IGF2BPs和circNDUFB2之间的相互作用。MeRIP观察到circNDUFB2中m6A显著富集，敲除METTL3和METTL14可显著降低circNDUFB2中m6A修饰水平，且不会改变circNDUFB2水平，METTL3/14敲除显著损害了circNDUFB2和IGF2BPs之间的相互作用。circNDUFB2未显著改变IGF2BPs的mRNA水平，但在circNDUFB2过表达中IGF2BPs的蛋白水平显著降低，在circNDUFB2敲低中增加。circNDUFB2过表达显著降低了IGF2BP蛋白的水平，这可被MG132（一种特异性蛋白酶体抑制剂）恢复。circNDUFB2显著增加IGF2BPs的泛素化水平，但该作用因其突变而受损。这些结果证明circNDUFB2通过增强泛素/蛋白酶体依赖性降解降低IGF2BPs的稳定性。

4. TRIM25是介导IGF2BPs泛素化的E3连接酶，circNDUFB2作为一个支架，增强IGF2BP蛋白与TRIM25的结合
为鉴定IGF2BPs泛素化的E3连接酶，对RNA下拉沉淀物进行质谱分析。在156个潜在的相互作用蛋白中发现了两个E3连接酶，TRIM25和HECTD3。circNDUFB2与TRIM25的结合，circNDUFB2与TRIM25共定位在细胞质中。TRIM25与所有三种IGF2BPs结合，共定位在细胞质中。IGF2BPs的mRNA水平不受TRIM25影响，但IGF2BPs的蛋白水平在TRIM25敲低中显著增加，在TRIM25过表达中显著降低。同时，在TRIM25过表达的A549细胞中，IGF2BPs的泛素化水平显著增加。这些结果表明，TRIM25在NSCLC细胞中与IGF2BP蛋白相互作用，并通过泛素-蛋白酶体途径降解。

探索TRIM25对IGF2BPs的泛素连接酶活性是否依赖于circNDUFB2。circNDUFB2的缺失显示TRIM25对IGF2BPs泛素化和降解的减弱作用。为进一步验证circNDUFB2是否作为支架增强TRIM25与IGF2BPs的结合，进行Co-IP分析。在circNDUFB2而非circNDUFB2-MUT过表达的细胞中，TRIM25和IGF2BPs之间的关联增强。RNase A处理严重破坏了相互作用。在METTL3/14敲除后，IGF2BPs的泛素化显著减少。综上所述，表明circNDUFB2作为支架增强TRIM25和IGF2BPs之间的相互作用，随后促进TRIM25介导的IGF2BPs的泛素化和降解。

5. circNDUFB2触发NSCLC细胞的免疫防御反应

RNA-seq显示，circNDUFB2过表达影响934个基因的表达水平，GO和KEGG分析显示circNDUFB2触发免疫防御和I型干扰素(IFNs)信号，GSEA也显示参与免疫应答的靶基因的信号通路。circNDUFB2敲低降低了NSCLC细胞中免疫基因的水平，说明过表达circNDUFB2，导致免疫基因上调。ELISA证实，circNDUFB2过表达可显著增加细胞培养上清液中CXCL10、CXCL11、CCL5和IFNβ的水平，circNDUFB2敲低可降低细胞培养上清液中这些细胞因子的水平。这些结果证明circNDUFB2在NSCLC细胞中引发免疫反应。

6. RIG-I对于circNDUFB2诱导的免疫反应至关重要

维甲酸诱导基因-I(RIG-I)敲低可消除circNDUFB2过表达诱导的免疫应答，RIG-I被circNDUFB2上调。circNDUFB2与RIG-I结合，共定位在细胞质中。circNDUFB2显著上调RIG-I、IRF7、IFNβ和TNF的蛋白水平，不影响P65和IRF3的蛋白水平，circNDUFB2显著增加p-P65、p-IRF3、p-STAT1和p-STAT2，促进IRF3和P65易位进入细胞核。RIG-I敲低显著消除circNDUFB2诱导的基因的蛋白水平或磷酸化水平的上调以及IRF3和P65的核转位。上述结果提示，RIG-I介导circNDUFB2引起的免疫应答。circNDUFB2抑制CARDs和RIG-I的解旋酶结构域之间的相互作用，增强CARDs与线粒体抗病毒信号蛋白的相互作用，表明circNDUFB2可通过破坏CARDs与其解旋酶结构域之间的分子内相互作用，并使RIG-I保持活性形式，随后引发RIG-I-MAVS信号级联的激活，从而激活RIG-I。

本文的机制图：