circSDHC-肾细胞癌的治疗靶点

越来越多的证据表明，circRNAs在癌症的发展和进展中发挥着重要的调控作用；然而，circRNAs在肾细胞癌(RCC)中的表达模式和生物学功能在很大程度上仍不清楚。小编今天给大家带来发表于影响因子为15.302的杂志“Molecular Cancer”上的文章“Circular RNA circSDHC serves as a sponge for miR-127-3p to promote the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma via the CDKN3/E2F1 axis”。

在本研究中，我们对GEO数据库中已发表的circRNA芯片数据进行了生物信息学分析，确定circSDHC可能在RCC的发展和进展中起致癌作用。通过体外和体内实验，我们证明circSDHC作为miRNA-127-3p的海绵，从而调控CDKN3/E2F1轴。因此，circSDHC是一个很有前景的RCC患者潜在的预后生物标志物和治疗靶点。

技术路线

结果
1）RCC中致癌circRNA的发现和circSDHC的表征

我们利用circRNA芯片分析人体组织样本的两个GEO数据集(GSE137836和GSE100186)，研究了circRNA在RCC发展和进展中的作用。我们选择了log2 foldchange > 1或<−1，p < 0.05的circRNA，如图1a所示。我们提取了两个数据集重叠的circRNA，这些circRNA代表了RCC中一致的调节模式，产生了434个circRNA子集(图1b)。我们选择了20个最显著上调的circRNA，绘制了热图(图1c)。相关分析表明，circSDHC表达与临床病理参数TNM分期相关。此外，单因素和多因素Cox分析均表明，较高的circSDHC表达与不良生存结局相关。circSDHC来源于第1染色体上的SDHC基因，由外显子2、3、4和5的反剪接产生(385 bp)。我们通过Sanger测序确认了circSDHC的反剪接连接(图1d)。与正常肾上皮细胞系HK2相比，4个RCC细胞系(Caki-1, A498, 786-O, 769P)的circSDHC表达升高(图1e)。PCR分析证实，不同的引物可以从cDNA中扩增circSDHC，但不能从gDNA中扩增(图1f)。此外，circSDHC对RNase R处理更耐药，而SDHC mRNA在此处理下显著降解(图1g)。CircSDHC的半衰期也比SDHC mRNA长，放线菌素D处理证实了这一点(图1h)。此外，通过FISH实验分析了circSDHC在786-O细胞中的亚细胞定位，表明大部分circSDHC定位于细胞质(图1i)。

2）CircSDHC促进RCC增殖和侵袭性

为了评估CircSDHC在RCC中的生物学作用，我们进行了功能测定。为了操纵circSDHC的表达，我们构建了针对反剪接连接的siRNA(图2a)。在circSDHC水平最高的两株RCC细胞系(786-O和A498)中，利用sirna成功敲低了circSDHC的表达，且不改变SDHC mRNA的线性表达(图2b)。敲低circSDHC显著减少了786-O和A498细胞迁移和入侵的能力 (图2 c, e)。此外，敲除circSDHC后，这些细胞的增殖也受到抑制(图2 d, f)。为了进一步研究其功能，我们构建了一个circSDHC过表达载体，该载体在另一个RCC细胞系769P中显著上调了circSDHC的水平(图2 g)。与敲除实验结果一致的是，circSDHC过表达可增加769P细的迁移、侵袭和增殖率(图2h, i)。

3）肿瘤抑制因子miR-127-3p是circSDHC在RCC中的一个靶点

由于我们的数据表明circSDHC定位于细胞质，我们试图确定它是否可以作为miRNA海绵。首先，我们利用两个数据库预测了可能受circSDHC调控的下游miRNAs。四个miRNAs，包括miR-3612、miR650、miR-519a-3p和miR-127-3p，在两个数据库中都被鉴定为circSDHC的潜在靶标(图3a)。为了进一步评估circSDHC与miRNAs之间的关系，我们构建了生物素标记的circSDHC探针，qRT-PCR证实了该探针可以特异性下拉circSDHC(图3b, c)。接下来，使用该探针下拉786-O和A498细胞中与circSDHC结合的miRNAs。随后的qRT-PCR证实miR-127-3p可以在786-O和A498细胞中与circSDHC结合(图3d)。接下来，我们进行了荧光素酶报告基因检测，结果证实了之前的研究结果(图3e)。此外，生物素标记的miR-127-3p比阴性对照探针捕获的circSDHC更多(图3f)，在786-O细胞中的FISH分析显示，circSDHC和miR-127-3p共定位于细胞质中(图3g)。此外，我们对ccRCC患者数据的分析显示，miR-127-3p与circSDHC呈负相关(图3h)。这些结果表明，circSDHC可以与miR-127-3p结合，充当miR-127-3p的海绵。最后，在786-O和A498细胞中过表达miR-127-3p可降低攻击性和增殖(图3i-l)。

4）miR-127-3p通过下调CDKN3/E2F1轴抑制RCC进程

我们利用ENCORI数据库确定miR-127-3p调控的靶基因和下游通路。Cyclin依赖性激酶抑制剂3 (CDKN3)被鉴定为miR-127-3p调控的潜在候选基因 (图4a)。此外，我们进行了双荧光素酶报告基因检测，其中含有野生型CDKN3序列的载体与miR-127-3p模拟物共转染，导致荧光素酶活性降低50%以上。相比之下，转染含有突变CDKN3序列的载体对荧光素酶活性没有影响(图4b)。Western blot检测证实了这一调控(图4c)。这些结果表明，miR-127-3p可通过下调CDKN3抑制RCC进程。此外，RCC细胞中CDKN3基因敲除导致细胞增殖率降低，迁移和侵袭能力减弱(图4d-g)。为了预测涉及CDKN3下游的通路，我们使用了基因集富集分析。结果表明E2F1是一个潜在的参与途径(图4h)。E2F1是一种有效的转录调控因子，参与多种不同类型癌症的发展。GEPIA预测显示CDKN3与E2F1水平呈正相关(图4i)，在786-O和A498细胞中CDKN3敲除后的western blot分析证实了这一关系(图4 -k)。

5）circSDHC作为miR-127-3p的海绵，调节CDKN3/E2F1，促进RCC进展

为了研究circSDHC是否通过对miR-127-3p的海绵作用促进RCC进展，我们使用miR-127-3p抑制剂和模拟物在circSDHC缺失或过表达后进行拯救实验。敲低circSDHC抑制786-O细胞的侵袭和增殖；然而，miR- 127-3p抑制剂可以挽救这种抑制作用(图5 a, c)。在过表达circSDHC的769P细胞中也观察到类似的效果，这些细胞表现出更强的攻击性和增殖能力，而miR-127-3p mimic可减弱这些能力(图5 b, d)。Western blot检测结果也与观察到的功能变化一致，转染circSDHC siRNA后，CDKN3和E2F1通路被激活较少，而miR-127-3p抑制剂可以挽救这一过程(图5e)。相比之下，转染circSDHC过表达载体可激活CDKN3/E2F1通路，而在769P细胞中引入miR127-3p mimic可降低这一效应(图5f)。

6）敲除circSDHC可抑制RCC的体内肿瘤进展

为了评估circSDHC在体内的致癌作用，在786-O细胞中稳定转染靶向circSDHC的shRNA(图6a)。注射circSDHC敲低癌细胞的小鼠比对照组表现出更少的恶病质，表现为小鼠体重的变化(图6b)。8周后对实验组和对照组小鼠实施安乐死，收集肺组织。注射了circSDHC敲除癌细胞的小鼠肺的转移灶比对照组少(图6c)。皮下肿瘤形成评估表明，circSDHC敲除组的总体平均肿瘤体积(图6d)和肿瘤重量(图6e)明显低于对照组。对这些皮下肿瘤的免疫组化分析显示，circSDHC敲低组CDKN3和E2F1表达水平降低(图6f)，两组间CDKN3和E2F1的免疫组化评分显著(图6g)。这些结果表明，敲除circSDHC可在体内抑制RCC肿瘤进展。

结论

综上所述，circSDHC在ccRCC中过表达，且其过表达与低存活率相关。此外，circSDHC通过充当miR-127-3p的海绵，促进ccRCC的进展和转移。miR-127-3p是一种肿瘤抑制因子，可下调CDKN3/E2F1轴的活性。