Tempol：超氧化物歧化酶模拟物可用于改善多囊卵巢综合征

多囊卵巢综合征（PCOS）是一种复杂的内分泌和代谢紊乱疾病，通常伴有氧化应激。Tempol是一种超氧化物歧化酶（SOD）模拟物，可预防由氧化应激引起的多种疾病。但是，目前尚不清楚tempol对PCOS的影响。本文通过肠道微生物组的16S rDNA测序和非靶向代谢组学分析脱氢表雄酮（DHEA）诱发的PCOS卵巢功能障碍和葡萄糖耐量减轻的大鼠模型回答了该问题，并于2021年2月发表在《Redox Biol》IF：9.986。

技术路线：

主要实验结果：

1. Tempol减轻DHEA诱导的PCOS大鼠卵巢功能障碍和细胞凋亡

实验过程设计如图1A所示。用发情周期观察DHEA和/或tempol对卵巢功能的影响，如图1B所示，oil+ PBS组大鼠的动情周期为4 ~ 5天，而DHEA + PBS组大鼠大多处于动情期(图1B)。经tempol处理后，发情周期紊乱得到改善(图1B)。H&E染色显示oil+ PBS组卵巢在不同发育阶段均出现卵泡和少量新鲜黄体(图1C)。与对照组相比，DHEA + PBS组的囊泡数量较多，黄体数量较少。另一方面，tempol处理减少了囊泡的数量，增加了黄体的形成(图1C-E)。检测了血清睾酮、eE2、LH、PRGE、FSH 5种性类固醇激素水平。DHEA + PBS组血清睾酮水平明显高于oil+ PBS组。Tempol显著降低PCOS大鼠血清睾酮和eE2水平，但对血清LH、PRGE、FSH水平无明显影响(图1F)。DHEA处理的大鼠血清胆汁酸水平显著降低，但这种减弱在DHEA + tempol组消失了(图1G)。在DHEA + PBS组大鼠卵巢中，cleaved caspase-3的表达增加，而在tempol作用下，cleaved caspase-3的表达减少(图1H)。TUNEL染色显示，tempol显著降低DHEA处理大鼠的凋亡细胞比例(图1I)。提示tempol可改善PCOS大鼠卵巢功能障碍及卵巢组织病理损伤。

图1 Tempol减轻DHEA诱导的PCOS大鼠卵巢功能障碍和细胞凋亡

2. Tempol能中度改善DHEA诱导的PCOS大鼠的糖耐量

由于多囊卵巢综合征与代谢紊乱密切相关，评估了不同组的胰岛素敏感性和葡萄糖稳态。DHEA + PBS组大鼠的空腹血糖水平虽然没有明显差异，但其空腹血清胰岛素水平和HOMA-IR值均高于油+ PBS组。Tempol显著降低了空腹胰岛素水平，而对PCOS大鼠的空腹血糖水平和HOMA-IR值无显著影响(图2A-C)。OGTTs显示PCOS大鼠葡萄糖清除延迟和曲线下面积增加，这表明DHEA处理降低了葡萄糖排泄能力。经tempol治疗后，糖耐量受损情况得到改善(图2D)。ITTs证明，三组大鼠对胰岛素的反应相同(图2E)。

图2 Tempol对PCOS大鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性的影响 

3. Tempol可改善PCOS大鼠全身和肠道的氧化应激

DHEA + PBS组大鼠血清MDA水平明显高于油+ PBS组，血清T-AOC水平明显低于oil+PBS组。给药Tempol可显著降低PCOS大鼠血清MDA水平，提高血清T-AOC水平(图3A-B)。研究发现，DHEA联合或不联合tempol对血清3’-NT和AGEs水平均无影响(图3C-D)。

作者测定卵巢中氧化应激生物标志物的水平，PCOS大鼠卵巢MDA、3-NT、AGEs水平高于对照组，但差异无统计学意义(图3E-G)，PCOS大鼠卵巢T-AOC水平未见明显下降(图3H)；然而，这些大鼠的SOD活性降低(图3I)。WB分析显示，PCOS大鼠卵巢中SOD1表达下降，而SOD2表达未发生变化(图3J)。Tempol对PCOS大鼠这些氧化应激标志物的水平没有明显影响，甚至进一步降低了卵巢SOD活性(图3E-I)，这表明Tempol对卵巢氧化应激没有直接影响。

由于肠道微生物群在多囊卵巢综合征的起始和发展中起着重要作用，作者还研究DHEA和tempol是否影响肠道的氧化还原状态。肠道MDA、3-NT和AGEs水平在PCOS大鼠中显著高于对照组和氧化生物标记的增加被tempol处理消除(图3K-M)。此外，tempol显著增加PCOS大鼠的肠道SOD1和SOD2表达(图3N)。因此，这些结果表明tempol能够降低PCOS大鼠的肠道氧化应激。

图3 Tempol对PCOS大鼠全身、卵巢和肠道氧化应激的影响

4. Tempol减轻PCOS大鼠肠道微生物失调

随后，通过rarefaction和Shannon曲线(Fig. 4A-B)，以及4个α-多样性指数(ACE)、Shannon、Simpson和Chao1来评估细菌群落的丰度和多样性。当序列增加到2000时多个样本稀疏曲线往往是平坦的，这表明测序数据的数量是合理的(图4C-F)。在多个样本Shannon曲线也观察到类似的结果(图4 g)，表明大多数样本多样性被测序覆盖。有趣的是，rarefaction和Shannon曲线以及4个α-多样性指数的结果在不同组间没有差异(图4A-F)，这表明DHEA处理或tempol干预对肠道微生物群α-多样性没有明显影响。

其次，采用UPGMA、PCoA和NMDS评估不同群体的肠道菌群β-多样性。UPGMA聚类方法将对照组和PCOS大鼠样本分为两组，表明PCOS大鼠和对照组的肠道微生物分布不同。虽然DHEA + tempol组不能完全与DHEA + PBS组分离，但与DHEA + PBS组有所不同，说明给药tempol影响了PCOS大鼠的肠道微生物分布(图4G)。PCoA和NMDS分析进一步显示，三组大鼠肠道总体微生物组成不同(图4H-I)，而Permanova/ Anosim分析表明，三组间差异显著(图4J)。上述结果表明，DHEA和tempol处理可影响肠道微生物的β-多样性。

图4 Tempol对肠道微生物多样性的影响

采用LEfSe方法分析经DHEA和tempol处理后显著改变的关键系统发育类型。Desulfovibrionaceae属富集于oil+ PBS组，而Muribaculaceae 和Alloprevotella属富集于DHEA+ PBS和DHEA+ tempol组 (图5A-B)，这表明tempol可以重塑微生物PCOS大鼠的肠道微生物群的结构。

通过分析细菌分类在门和属水平上的相似性程度，进一步比较三组肠道菌群的整体组成。在门水平上，厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是3个类群的优势门(图5)。DHEA处理增加了放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、Patescibacteria、软毛杆菌门(Tenericutes)和Verrucomicrobia的丰度，减少了psilonbacteraeota和变形菌门(Proteobacteria)的数量。然而，在tempol干预下，放线菌门、Patescibacteria门、变形菌门和Tenericutes门的变化减弱了(图5D)。在属水平上，Lachnospiraceae_NK4A136_group和Multibaculaceae为优势属(图5E)。DHEA显著提高了thaauera、葡萄球菌、Ideonella、棒状杆菌和瘤胃球菌_2的丰度，降低了瘤胃球菌_1的丰度。这些变化被tempol处理抵消了(图5F)。

图5在门、属水平上回肠微生物群落分类组成的变化

5. 肠道微生物群和循环代谢产物之间的联系

采用非靶向代谢组学方法测量三组血清代谢产物，并研究肠道微生物组和宿主循环代谢产物之间的关系。主成分分析(PCA)显示，三组间主要代谢成分差异显著(图6A)。OPLS-DA的监督正交投影评分图也显示出PCOS大鼠与对照组、DHEA + PBS组与DHEA + tempol组之间的明显区别(图6B)。图6C列出了三组52种血清代谢物(包括26种脂类及类脂分子)的相对丰度，说明PCOS大鼠大部分血清代谢物的丰度与对照组大鼠完全不同，说明DHEA治疗对血清代谢有深远的影响。PCOS大鼠服用Tempol后，血清代谢产物的丰度也发生了显著变化，引起28种血清代谢物丰度的变化在tempol作用下部分减弱(图6C)。

图6 Tempol影响血清代谢组学

随后，通过进行spearman分析，研究了所有三组循环代谢产物丰度与肠道微生物群之间的联系，以测试33个属与52个代谢产物之间的关联，其中有11个代谢物与各属均无显著相关(图7A)。其余甘油磷脂类只与一两种属相关，而多不饱和脂肪酸(8-HETE, 8,9 - DiHETrE, 20-羟基二十甲酸)与至少7个属显著相关。此外，血清水苏糖与瘤胃球菌1或2之间的相关性表明，PCOS大鼠血清水苏糖水平降低与瘤胃球菌1丰度降低和瘤胃球菌2丰度增加有关(图7B-C)。当tempol干预改变瘤胃球菌_1和_2的丰度时，PCOS大鼠血清水苏糖水平升高。

图7肠道微生物种类和循环代谢产物之间的联系

6. 水苏糖减轻DHEA诱导的多囊卵巢综合征大鼠卵巢功能障碍

为了确定水苏糖是否参与了Tempol对PCOS大鼠的有益作用，DHEA处理的大鼠给予200 mg/kg水苏糖12天。水苏糖给药对体重没有明显影响(图8A)，但改善了PCOS大鼠的动情周期紊乱(图8B)。H&E染色表明，水苏糖可减少卵巢囊泡数量，增加黄体形成(图8C-E)。水苏糖还可显著降低PCOS大鼠血清睾酮水平的升高(图8F)。上述结果提示水苏糖确实改善了PCOS大鼠卵巢功能障碍，改善了卵巢组织病理损伤。

图8水苏糖改善DHEA诱导的多囊卵巢综合征大鼠卵巢功能障碍

综上所述，Tempol通过降低肠道氧化应激、恢复肠道失调、调节肠道微生物和宿主代谢产物之间的相互作用来保护DHEA诱导的多囊卵巢综合征(PCOS)(图9)。这些结果表明Tempol是一种潜在的治疗多囊卵巢综合征的策略。

图9改善糖耐量和多囊卵巢的潜在信号通路图