circNDUFB2通过使IGF2BP不稳定并激活抗肿瘤免疫力来抑制非小细胞肺癌的进展

肺癌是最常被诊断的癌症之一，也是导致癌症死亡的主要原因，非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌病例的85％。环状RNA（circRNA）是一类共价闭合的单链RNA，与癌症的发展有关。今天我们来看一篇发表在Nature Communications期刊的一篇文章，题名为：circNDUFB2 inhibits non-small cell lung cancer progression via destabilizing IGF2BPs and activating anti-tumor immunity。

circNDUFB2在NSCLC中被下调

通过circRNA芯片分析了三对NSCLC样品中circRNA的表达谱，总共鉴定出109个circRNA失调，33个上调，76个下调。qRT-PCR验证52个配对NSCLC样品中前五差异circRNA的表达。circNDUFB2是最显着下调的circRNA。临床分析发现circNDUFB2高表达与NSCLC患者的肿瘤大小、淋巴结转移和分期呈负相关。结果表明，circNDUFB2在NSCLC中经常被下调，并且与NSCLC的恶性特征呈负相关。circNDUFB2由NDUFB2基因的外显子2–3产生，长度为249 nt。circNDUFB2可由发散引物扩增，收敛引物不能扩增。核酸酶消化证实circNDUFB2具有闭环结构。放线菌素D处理表明，与NDUFB2 mRNA相比，circNDUFB2是稳定的。核质分离PCR以及荧光原位杂交（FISH）显示circNDUFB2主要定位于细胞质中。这些结果表明circNDUFB2是一个circRNA。

QKI促进NSCLC细胞中circNDUFB2的生物发生

circNDUFB2和NDUFB2均来自NDUFB2 pre-mRNA，而NDUFB2 mRNA在NSCLC中略有上调。因此，推测circNDUFB2的下调在转录后发生。我们在circNDUFB2中搜索与潜在QRE匹配的序列。接下来进行了RIP分析，确认QKI确实与NDUFB2 pre-mRNA中的假定QRE结合。在NSCLC细胞中QKI过表达可能会上调circNDUFB2。 这些数据表明，QKI与NDUFB2 pre-mRNA的circNDUFB2形成外显子侧翼的内含子结合，从而促进circNDUFB2的形成。

circNDUFB2抑制NSCLC进展

体外研究表明circNDUFB2过表达显着抑制了NSCLC细胞的增殖，迁移和侵袭，而circNDUFB2敲低显着促进了这些表型。体内实验表明circNDUFB2过表达可显着抑制NSCLC细胞的致瘤性和转移。这些数据表明circNDUFB2可能在NSCLC进展中起抑制作用。

circNDUFB2与NSCLC细胞中的IGF2BP1/2/3相互作用

为了探索circNDUFB2是否通过与蛋白质相互作用发挥功能，RNA pulldown来鉴定与其相关的蛋白质。RNApulldown沉淀物通过SDS-PAGE分离。银染后，切下约65 kDa的有义特异性条带，并使用质谱进行分析。发现前三个丰富的蛋白质分别是IGF2BP2，IGF2BP1和IGF2BP3。使用Western blot和RIP分析证实了这一结果。此外， RNA FISH免疫荧光分析，发现circNDUFB2与IGF2BPs共定位在细胞质中。为了探讨IGF2BPs的KH域对于与circNDUFB2之间的相互作用，构建IGF2BPs突变体，KH结构域突变明显减少了IGF2BP与circNDUFB2之间的相互作用。接下来进行了circNDUFB2突变，发现circNDUFB2突变显着降低了IGF2BP与circNDUFB2之间的相互作用。

IGF2BP结合区域包含“ GGAC” N6-甲基腺苷（m6A）核心基序。IGF2BPs是m6A结合蛋白。为了探索circRNA和IGF2BP之间的相互作用是否通过m6A依赖性的方式进行调节，对circNDUFB2进行了MeRIP，并观察到circNDUFB2中m6A的显着富集。敲低METTL3和METTL14显着降低了circNDUFB2中m6A修饰的水平，并且没有改变circNDUFB2的水平。METTL3 / 14敲低显着削弱了circNDUFB2和IGF2BP之间的相互作用。 这些数据表明，circNDUFB2以依赖于m6A的方式与三个IGF2BP物理相互作用。

circNDUFB2过表后IGF2BPs的mRNA无显著变化，蛋白质水平显著降低。此外，circNDUFB2突变体不影响IGF2BPs的蛋白质水平。因此推测circNDUFB2可能通过相互作用使IGF2BP蛋白失稳。发现circNDUFB2的过度表达显著降低了IGF2BP蛋白的水平，这可以通过MG132（蛋白酶抑制剂）恢复。circNDUFB2显著增加了IGF2BPs的泛素化水平，但这种作用因其突变而受损。这些结果表明circNDUFB2通过促进泛素/蛋白酶体依赖性降解降低IGF2BPs的稳定性。

TRIM25是介导IGF2BP泛素化的E3连接酶

为了进一步鉴定IGF2BPs泛素化的E3连接酶，RNA pulldown质谱结果中在156种潜在的相互作用蛋白中发现了两种E3连接酶TRIM25和HECTD3。 使用WB分析， TRIM25与circNDUFB2特异性相关。 RIP分析进一步证实了circNDUFB2与TRIM25的关联。RNA FISH免疫荧光分析表明circNDUFB2与TRIM25在细胞质中共定位。进行Co-IP结果显示TRIM25与所有三个IGF2BP结合。免疫荧光分析表明TRIM25与所有三个IGF2BP蛋白共定位在细胞质中。IGF2BPs的mRNA水平不受TRIM25的影响，但是在TRIM25敲低时，IGF2BPs的蛋白水平显着增加，而在TRIM25的过表达中，IGF2BPs的蛋白水平分别降低。在TRIM25过表达的A549细胞中，IGF2BP的泛素化水平显着增加。这些结果表明，TRIM25是E3泛素连接酶，可与IGF2BP蛋白相互作用，并通过泛素-蛋白酶体途径降解NSCLC细胞。

TRIM25的RNA结合活性对于其对底物的泛素连接酶活性是必需的。构建了一个带有FLAG标记RNA结合域（RBD）缺失突变体。TRIM25ΔRBD不影响IGF2BPs的蛋白质水平，对IGF2BPs的泛素化水平没有明显影响，表明TRIM25完整的RBD对于IGF2BPs的有效泛素化和降解是必要的。这些结果表明，TRIM25通过泛素-蛋白酶体途径促进NSCLC细胞中IGF2BPs的降解，并且TRIM25的RNA结合活性对其在底物泛素化中的作用至关重要。

已经显示，TRIM25使用RNA作为其靶标有效泛素化的支架。然后，探讨了TRIM25对IGF2BPs的泛素连接酶活性是否取决于circNDUFB2的存在。 circNDUFB2的丢失显示了TRIM25对IGF2BPs泛素化和降解的显着减弱作用。进一步验证实验数据并检查circNDUFB2是否充当支架来增强TRIM25与IGF2BP的结合，进行了Co-IP分析。在带有circNDUFB2但没有circNDUFB2-MUT过表达的A549细胞中，TRIM25和IGF2BP之间的关联得到增强。由于circNDUFB2对RNA核酸外切酶的抗性，使用RNase A治疗会严重破坏相互作用。此外，在METTL3 / 14敲低后，IGF2BP的泛素化作用显着降低。结果表明，circNDUFB2充当支架，以增强TRIM25和IGF2BPs之间的相互作用，随后促进TRIM25介导的IGF2BPs泛素化和降解。

IGF2BPs是circNDUFB2的下游功能性蛋白

IGF2BPs是致癌蛋白，circNDUFB2可降低IGF2BPs的稳定性，推测IGF2BPs介导circNDUFB2对NSCLC进展的影响。IGF2BPs过表达显著增加了A549细胞的迁移和侵袭能力以及集落形成能力。IGF2BPs敲除显著降低H1650细胞的迁移和侵袭能力以及集落形成能力。这些结果证实IGF2BPs是NSCLC的促瘤因子。随后，观察到IGF2BPs过度表达仅部分恢复了circNDUFB2过度表达减少的迁移和侵袭能力以及集落形成能力，表明circNDUFB2部分通过降解IGF2BPs发挥肿瘤抑制作用。尽管circNDUFB2 MUT不影响IGF2BPs的蛋白质水平但它仍然对NSCLC细胞的进展具有抑制作用。这些数据表明circNDUFB2 MUT的抑制作用除了降解IGF2BPs外，还可能与circNDUFB2的其他机制有关。

circNDUFB2触发NSCLC细胞的免疫防御反应

为了研究参与circNDUFB2的信号通路，使用RNA测序（RNA-seq）进行了转录组分析。结果表明circNDUFB2过表达影响934个基因的表达水平，其中743个基因上调，191个基因被下调。基因本体生物学过程（GO_BP）和KEGG途径富集分析表明circNDUFB2触发了免疫防御和I型干扰素（IFNs）信号传导。基因集富集分析（GSEA）也表明目标基因的信号传导途径参与了免疫反应。确认了在circNDUFB2过表达的NSCLC细胞中一组免疫基因表达被上调，而circNDUFB2敲低降低了NSCLC细胞中这些基因的水平。这些结果表明，过量表达circNDUFB2，而不是其具有相同序列的线性RNA片段，导致免疫基因上调。 酶联免疫吸附试验（ELISA）证实circNDUFB2过表达显着增加了细胞培养上清液中CXCL10，CXCL11，CCL5和IFNβ的水平，而circNDUFB2敲低降低了细胞培养上清液中这些细胞因子的水平。这些结果证明circNDUFB2在NSCLC细胞中引发免疫应答。

RIG-I对circNDUFB2诱导的免疫反应至关重要

RIG-I样受体（RLR）家族可识别病毒RNA 会通过产生IFN和促炎性细胞因子来触发针对病毒感染的先天免疫反应。已经报道外源circRNA有效刺激由RIG-1介导的免疫信号传导。从qRT-PCR分析获得的数据表明，RIG-1敲低消除了circNDUFB2过表达诱导的免疫反应，RIG-1被circNDUFB2上调。为了研究circNDUFB2和RIG-I之间的关联，进行RIP分析和RNA FISH免疫荧光实验。 结果表明circNDUFB2与RIG-1结合，并且它们共定位在细胞质中。 circNDUFB2过表达后， circNDUFB2显着上调了RIG-1，IRF7，IFNβ和TNF的蛋白水平，而circNDUFB2则不影响P65和IRF3的蛋白水平。同时，circNDUFB2显着增加了p-P65，p-IRF3，p-STAT1和p-STAT2。circNDUFB2还促进了IRF3和P65进入核内的易位。免疫荧光分析证实circNDUFB2促进了IRF3的磷酸化，并随后触发其转移到细胞核中。更重要的是，RIG-1的敲除显着消除了这些基因的蛋白质水平或磷酸化水平的上调以及由circNDUFB2诱导的A549细胞中IRF3和P65的核易位。ELISAs测量细胞培养上清液中的细胞因子水平，发现RIG-1敲低显着消除了对CXCL10，CXCL11，CCL5和IFNβ的诱导。上述结果表明RIG-1在介导NSCLC细胞中circNDUFB2的免疫应答中起关键作用，而circNDUFB2引发的免疫应答不依赖于circNDUFB2中m6A的修饰。

在没有RNA配体的情况下，RIG-I采用一种自动抑制的构象，CARDs发出信号。因此假设circNDUFB2可能通过促进其CARDs释放激活RIG-I。用Co-IP检测RIG-I的CARDs（FLAG-CARD）和螺旋酶结构域（HA-ΔCARD）之间的相互作用。结果表明circNDUFB2抑制了RIG-I的CARDs和螺旋酶结构域之间的相互作用。此外，circNDUFB2增强了CARDs与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）的相互作用。这些结果表明circNDUFB2可能通过破坏CARDs与其解旋酶结构域之间的分子内相互作用来激活RIG-I，并使RIG-I保持活性，从而激活RIG-I-MAVS信号级联。

circNDUFB2的免疫反应抑制NSCLC进展

为了研究circNDUFB2是否具有刺激免疫反应的潜力，然后将免疫细胞募集到肿瘤微环境（TME）中，通过皮下将具有或不具有circNDUFB2过表达的LLC1（LL / 2，鼠肺癌细胞系）细胞递送至C57BL / 6小鼠 注射。 三周后，我们发现circNDUFB2过表达显着抑制了体内LLC1细胞的致瘤性，而在CircNDUFB2过表达LLC1细胞的小鼠中血清IFNβ的水平显着升高。此外，在从这些小鼠解剖的肿瘤组织中检测到CD8 + T细胞和DC的浸润，并且circNDUFB2过表达显着增加了TME中CD8 + T细胞和DC的频率。最后，分析了52例NSCLC患者肿瘤组织中circNDUFB2与RIG-I或IFNβ之间的相关性。结果表明circNDUFB2与RIG-1和IFNβ正相关。 以上结果表明，RIG-1介导的circNDUFB2的免疫反应抑制了肿瘤的进展。