脂质积累与急性肾损伤

急性肾损伤(Acute kidney injury, AKI)是一种起病急、进展快、预后差的严重临床急症。最近的证据表明，AKI伴随着显著的代谢异常，包括脂质代谢的改变。然而，脂质在AKI中的具体变化及其作用和调控机制目前尚不清楚。今天小编给大家带来于2021年3月发表在影响因子8.579的“Theranostics”的文章“Relieving lipid accumulation through UCP1 suppresses the progression of acute kidney injury by promoting the AMPK/ULK1/autophagy pathway”。本研究首次系统分析AKI中脂质组成的变化，发现脂质积累程度与UCP1高度相关。重要的是，通过上调UCP1缓解AKI中的脂质堆积，可以通过促进AMPK/ULK1/自噬通路，显著抑制AKI的进展。

技术路线

结果

1）AKI伴有明显的脂质积累，并与肾损伤的严重程度高度正相关

根据脂质代谢组学分析结果，我们发现AKI组织中各类甘油三酯(TGs)含量显著增加(图1A)。考虑到AKI中的脂质积累，我们进行实验来确定其临床意义。我们对不同严重程度的AKI动物标本进行油红O染色。结果显示，随着疾病进展的延长，小鼠肾组织脂质沉积逐渐增加(图1B)。在体外也发现了类似的结果，即随着细胞损伤的严重程度，脂质积累的程度增加(图1C)。这些结果说明AKI中的脂质积累与疾病的严重程度呈正相关。

2）UCP1在AKI中显著下调，且与肾损伤严重程度呈高度负相关

UCPs超家族与能量代谢密切相关，并在多种疾病中介导脂质消耗。基于UCPs的功能，我们通过western blot和免疫组化方法对正常C57小鼠肾组织中UCP1、UCP2和UCP3的表达进行了表征。结果显示，UCP1和UCP2表达较好，而UCP3几乎未检测到(图2A-B)。在UCPs中，UCP1被认为是脂质降解最关键的基因，而UCP2与之没有直接关系。因此，我们选择UCP1进行进一步分析，证实其在皮质小管中高表达，在髓质中部分表达，C57小鼠、Sprague-Dawley大鼠、Wistar大鼠肾小球、乳头几乎无表达(图2C-D)。为了进一步确认UCP1在肾脏中的表达位点，我们用凝集素染色显示肾脏的形态，然后对UCP1进行染色。结果显示，UCP1主要表达于肾小管以上结果提示，UCP1可能在肾小管的结构和功能中发挥着潜在的重要作用。

为了探讨UCP1与AKI之间的相关性，我们在体内、体外检测了UCP1在AKI模型中的表达。结果显示，UCP1在AKI小鼠中显著下调，更重要的是，随着肾损伤的加重，其表达量逐渐降低(图2E-F)。在体外，随着顺铂刺激时间的延长，HK2细胞中UCP1的表达降低(图2G)。这些结果表明UCP1与AKI的严重程度呈负相关。此外，随着AKI肾细胞损伤程度的增加，脂质的积累，UCP1的表达逐渐降低(图2H)。这一结果表明，UCP1在AKI中的表达可能影响脂质积累。

3）AKI中的脂质积累与UCP1高度负相关

在确定了UCP1与AKI中的脂质积累负相关后，我们试图阐明其潜在的关系。首先，我们使用UCP1特异性过表达慢病毒载体和UCP1激动剂CL316243构建UCP1上调的细胞模型(图3A)。如图3B所示，UCP1过表达显著降低了顺铂暴露HK2的脂质积累。UCP1激动剂CL316243也得到了类似的结果。这些结果表明，UCP1参与了AKI中脂质积累的调节。为了进一步验证这一调控关系，提高证据的可靠性，我们采用肾多点注射UCP1特异性过表达腺病毒的方法建立AKI过表达UCP1的动物模型(图3C-D)。油红O染色显示，过表达UCP1可显著缓解AKI动物模型中的脂质积累(图3E)。最后，使用UCP1激动剂CL316243在AKI动物模型中诱导UCP1过表达，也观察到了相同的结果(图3F-H)。因此，所有证据表明，随着UCP1表达的增加，AKI模型中的脂质含量降低。

4）体外实验表明，上调UCP1以减轻AKI期间的脂质积累，可通过影响炎症和凋亡，显著抑制疾病进展

越来越多的证据表明，在AKI中有明显的脂质积累和UCP1的异常表达，并与肾损伤的严重程度有很强的相关性。为了确定脂质积累是否影响AKI期间的细胞功能，我们首先使用UCP1过表达慢病毒和UCP1激动剂CL316243构建AKI细胞脂质积累清除模型。如图4A所示，在AKI中上调UCP1清除脂质积聚，导致肾小管损伤指数、NGAL显著下调，说明UCP1清除脂质积聚可显著减轻模型细胞的损伤。鉴于炎症和凋亡是AKI细胞损伤最重要和直接的原因，我们对上述细胞模型中的炎症和凋亡标记物进行了量化。IL-1β、IL-6和TNF-α随着UCP1的上调而显著降低(图4B-D)。在凋亡指标Bax和C-caspase 3中也观察到类似的趋势，而Bcl-2升高(图4E)。最后，通过TUNEL荧光染色直接定量评估细胞凋亡，证实上调UCP1缓解AKI模型细胞的凋亡(图4F)。

5）上调UCP1缓解AKI期间的脂质积累，显著抑制疾病进展

为了在体内验证脂质对AKI功能的影响，我们通过在肾脏多点注射过表达UCP1腺病毒，构建过表达UCP1动物模型，以消除脂质在AKI中的堆积。在UCP1过表达动物模型中，肾损伤指标NGAL明显降低(图5A)。HE和PAS染色显示肾脏形态有很大改善，肾小管损伤评分显示，在UCP1介导的脂质消耗增加后，肾小管损伤程度明显降低(图5B-C)。顺铂刺激后肾小管呈空泡变性，细胞扁平，管腔扩张，而UCP1过表达明显改善了病理改变。血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)这两项肾脏损伤指标也出现了类似的显著下降(图5D-E)。利用UCP1激动剂CL316243在AKI动物模型中缓解脂堆积，进一步验证了上述结果。治疗后NGAL显著降低(图5F)，肾脏形态、肾小管损伤评分、SCr、BUN均显著改善(图5G-J)。因此，在体内，上调UCP1以缓解AKI脂质积累可以抑制AKI进展。

6）上调UCP1减轻AKI中的脂质积累，可显著缓解体内炎症和凋亡

以上研究证实，在体外，上调UCP1可以通过抑制炎症和凋亡来抑制AKI的进展。为了探究其在体内的作用，我们在肾多点注射模型中检测了相应的指标。如图6A-E所示，炎症指标CD68、IL-1β、IL-6、TNF-α均显著降低，UCP1上调。在凋亡方面，凋亡指标Bax和C-caspase 3也随着UCP1的上调而降低，而Bcl-2随着UCP1的上调而升高(图6F)。TUNEL荧光染色也直接证明了UCP1上调导致的凋亡减少(图6G-H)。同样，我们也使用UCP1激动剂CL316243在动物模型中证实了同样的炎症和凋亡趋势(图6I-P)。

7）在体外，上调UCP1减少AKI期间的脂质积累可通过AMPK/ULK1途径促进自噬

自噬已被证实在AKI中发挥重要作用。因此，自噬已经成为我们关注的重要途径之一。在通过慢病毒转染过表达UCP1或UCP1激动剂CL316243的AKI细胞模型中，自噬相关指标显示AMPK/ULK1/自噬通路显著激活(图7A-B)。电子显微镜图像也显示，上调UCP1消除AKI中的脂质积累后，细胞自噬得到促进(图7C)。基于这些发现，为了验证自噬在UCP1功能中的重要性，我们进行了功能恢复实验。如图7D-F所示，氯喹抑制自噬显著逆转了顺铂组UCP1引起的炎症指标下降。同样，TUNEL染色显示，使用氯喹抑制自噬，可以明显逆转UCP1促进的凋亡抑制作用(图7G)。这些结果表明，脂质积累通过作用于AKI细胞自噬，在调节细胞功能方面发挥着重要作用。

8）在AKI期间上调UCP1减少脂质积累，可通过AMPK/ULK1途径促进体内自噬

我们发现UCP1在体外通过激活自噬来影响AKI中的细胞功能，我们探讨了这种情况在体内是否也会发生。结果表明，在动物模型中上调UCP1也能显著激活AMPK/ULK1/自噬通路(图8A)，免疫荧光和免疫组化分析进一步证实了这一点(图8B-C)。最后，CL316243上调UCP1后，AMPK/ULK1/自噬通路也被显著激活(图8D-F)。综上所述，我们的研究构建了AKI中脂质积累显著的模型，且这种积累的脂质与UCP1呈负相关。通过上调UCP1来清除AKI中积累的脂质，可以激活AMPK/ULK1/自噬通路来抑制疾病进展(图9)。

结论：UCP1直接调控AKI中的脂质积累，激活细胞自噬，从而显著抑制疾病进展。这为AKI的治疗提供了新的思路和靶点。